專利名稱：基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤壞死因子的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于一種酶抑制劑。特定言之，本發(fā)明關(guān)于一種基質(zhì)金屬蛋白酶與腫瘤壞死因子的抑制劑。
根據(jù)不同之作用標(biāo)的，MMP可分為三大類膠原酶(collagenase；MMP-1、MMP-8、MMP-13)、基質(zhì)溶素(stromelysin；MMP-3、MMP-10、MMP-11)、及明膠酶(gealtinase；MMP-2、MMP-9)。起初，MMP是以原酶(proenzyme)的形式分泌至ECM中，其需要藉由其它酵素之作用方能活化。其中一類該活化酵素系細(xì)胞膜上的MMP(membrane type MMP；MT-MMP)。MT-MMP(MMP-14、MMP-15、MMP-16與MMP-17)具有橫越細(xì)胞膜的部分，且對MMP原酶的活化是不可或缺的。
上述的MMP中，某些MMP(MMP-2、MMP-9)是有關(guān)連且其已于各種不同之腫瘤(例如，結(jié)腸、胃、頭與頸部、前列腺及肺之腫癌)中過度表現(xiàn)。例如，已有研究發(fā)現(xiàn)，與正常的黏膜(mucosa)相比較，MMP-2和MMP-9在結(jié)腸直腸(colorectal)的癌組織中皆過量表現(xiàn)。在胃癌和胰癌中，也有類似的發(fā)現(xiàn)(Gress T.M.，Muller-Pillasch F.，Lerch，M.M.，et al.Expressioin and in-situ localization ofgenes coding for extracellular matrix proteins and extracellular matrix degradingporteases in pancreatic cancer.Int.J.Cancer 1995，62407-413；Normura H，Sato H.Seiki M.et al.Expression of membrane type-matrix metalloproteinase in humangastric cancinomas.Cancer Res 1995；553263-3266；Parsons SL，Watson SA，BrownPD，et al.Matrix metalloproteinases.Br.J.Surg.1997，87160-166)。MMP-2和MMP-9的過度表現(xiàn)亦與腫瘤發(fā)展階段、腫瘤侵入，及胃腸癌、子宮頸癌、膀胱癌及肺癌之不良預(yù)后(poor prognosis)有關(guān)(Nuovo GJ，MacConnell PB，Simisir A，etal.Correlation of the in situ detection of polymerase chain reaction-amplifiedmetalloproteinase complementary DNA and their inhibitors with prognosis in cervicalcarcinoma.Cancer Res.1995，55267-275；Davies B，Wasman J，Wasan H，et al.Levels of matrix metalloproteinases in bladder cancer correlate woth tumor grade andinvasion.Cancer Res.1993，535365-5369；Brown PD，Bloxidge RE，Stuart NS，et al.Association between expression of activated 72-kilodalton gelatinase and tumorspread in non-small cell lung carcinoma.J.Natl.Cancer Inst.1993，85574-578)。雖然MMP于某些腫瘤中過度表現(xiàn)，但是不同腫瘤中MMP的過度表現(xiàn)是不一樣。例如，F(xiàn)ieberg等人研究在47種人類腫瘤的異種移植物(xenograft)中MMP-2、MMP-3及MMP-7的表現(xiàn)模式，其結(jié)果顯示不同部位中MMP-2的過度表現(xiàn)程度不同，例如軟組織肉瘤中為100％，黑色素腫瘤中為84％，睪丸癌中為53％，及膀胱癌中為26％(Fieberg H，Klostermeyer A，Schuler JB.Characterization of matrixmetalloproteinases in 47 human tumor xenografts who high expression of MMP2 inmelanomas and sarcomas(abstract no.3058).Proceedings of the 90th Annual Meetingof the American Association for Cancer Research.1999 April 10-13，Philadelphia(PA))。上述之結(jié)果顯示MMP-2對這些腫瘤是一個(gè)可行之治療標(biāo)的。
腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α；TNFα)在宿主的免疫系統(tǒng)中扮演一個(gè)重要的角色。TNFα使宿主對許多致病菌甚至某些病毒產(chǎn)生抵抗力。然而，即使TNFα在活化宿主的免疫系統(tǒng)上具有助益的功能，但是其若不受控制地大量制造(主要在系統(tǒng)性量上)，則仍能導(dǎo)致產(chǎn)生某疾病。在敗血性休克(septic shock)之致病機(jī)轉(zhuǎn)上，TNFα扮演重要的角色，其主要影響為引起低血壓與多重器官衰敗(multiple organ failure)。TNFα亦為惡病質(zhì)(cachexia)的主要調(diào)控者(mediator)，其會(huì)使癌癥病人異常地體重下降。通常在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液(synovial fluid)中可偵察到TNFα之存在。在許多不同之疾病中，TNFα都扮演著某種角色。因此，可利用能抑制TNFα釋出的藥物以治療多種與TNFα有關(guān)的疾病，例如風(fēng)濕癥關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)、Crohn氏疾病(Crohn′s disease)、牙垢硬化癥(plaque sclerosis)、敗血性休克(septic shock)、癌癥或與免疫不全有關(guān)的惡病。
發(fā)明簡述本發(fā)明的主要目的是提供一種化合物，其對MMP-2(明膠酶)及TNFα與其受體(TNFα-RI)的結(jié)合皆有抑制作用，該化合物為1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
本發(fā)明的另一目的是提供一種具有下述通式(I)之化合物，其對MMP-2(明膠酶)具有抑制作用 其中X系Zn(II)螫合基且系選自(CH2)nOH、(CH2)nNH2、(CH2)nSH、(CH2)mCOOH、(CH2)mCOOR、(CH2)mCONH2、(CH2)m″CONH-OH、(CH2)m″CONH-R、或(CH2)n＇O(PO3)m″(m″+1)，其中n＝2、3、4、或5，n′＝2或3，m＝1、2、3、或4，m′＝1、2、3、4、5或6，m″＝1、2、或3，且R＝Cm’H2m’+1或芳基。
前面之?dāng)⑹鲆约跋率鲋?xì)節(jié)討論，是用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明之范圍。
第2圖顯示漸增濃度之經(jīng)純化的MMP-2水解BG之結(jié)果。
第3A圖顯示蒲公英(Taraxacum mongolicum)的甲醇粗萃取液以填有5μm膠顆粒之TSK Gel ODS 80TM(TOSOH)逆相層析管柱(25cm×4.6mm)層析后所得的層析圖譜。
第3B圖顯示蒲公英的甲醇粗萃取液以填有5μm膠顆粒之TSK Gel ODS80TM(TOSOH)逆相層析管柱(25cm×4.6mm)層析后，經(jīng)純化所得1.5μg的1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(化合物1)的層析圖譜。
第4圖顯示化合物1對MMP-2之抑制效果。
第5圖顯示化合物1對ES-2細(xì)胞穿透潛力之抑制效果。
第6圖顯示化合物1對經(jīng)生物素(biotin)標(biāo)記之TNFα與TNFα-RI結(jié)合之抑制效果。
發(fā)明詳述MMP-2之純化MMP-2得自癌細(xì)胞，然后利用明膠-Sephose 4B(Pharmacia)加以純化。將自卵巢癌細(xì)胞(ES-2)所得之不含血清條件化(conditioned)培養(yǎng)基濃縮50倍，然后使用分子量30,000為分界之薄膜(YM-30，Amicon)進(jìn)行過濾，得到MMP-2。親和性基質(zhì)系藉由平衡緩沖液平衡，該平衡緩沖液是由50mM Tris.HCl(pH7.6)、10mM EDTA及0.01％Tween 20所組成，其含有0.5M NaCl。在經(jīng)由含有0.5M NaCl之平衡緩沖液大量沖洗后，附著在薄膜上之MMP-2則被含有1M NaCl之平衡緩沖液所流洗出來。
第1圖顯示在經(jīng)由染料Commassie Brilliant Blue R-250染色之酶譜(zymography)上分析明膠分解活性之MMP-2樣品。將0.1％明膠(Type B，J.T.Baker)與10％聚丙烯酰胺混合以制備電泳所需之膠體，其制備系請參考Deryugina，E.I.，Bourdon，M.A.，Reisfeld，R.A.，and Strongin，A.，“Remodeling ofcollagen matrix by human cancer cells requires activation and cell surface associationof matrix metalloproteinase-2”，Cancer Res.583734-3750(1998)。將MMP-2樣品與不含還原劑之SDS/PAGE的緩沖液混合，然后在4-8℃下進(jìn)行電泳分析。在電泳膠體上，使用染料Commassie Brilliant Blue R-250作為負(fù)面染色以顯示MMP-2的酶活性，如第1圖所示。箭頭所指之處即為具有活性之MMP-2所在位置。MMP-2樣品亦可藉由使用特定的單株抗體(NeoMarkers)以西方浸漬法(Western Blotting)進(jìn)行分析(未提供數(shù)據(jù))。
純化后之MMP-2(分子量約為64K)已具有活性。因此，使MMP-2活化之過程(如使用對-胺基苯基乙酸汞(APMA)處理MMP-2)是不需要的。以生物素標(biāo)記明膠將明膠溶解于20mM磷酸鹽緩沖液(PBS；pH7.2)中，其濃度為2mg/mL。加入生物素試劑(biotinamidocaproate N-hydroxysuccinimide ester；Sigma；溶解在DMSO中儲(chǔ)存)至該明膠溶液中，使其最終濃度為100μg/mL。將混合物置于室溫下30分鐘。過量的生物素酯則利用二次蒸餾水進(jìn)行透析2兩小時(shí)，再以PBS進(jìn)行透析加以除去。以未標(biāo)記的明膠作為濃度標(biāo)準(zhǔn)，并使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑(Bio-Rad)決定生物素標(biāo)記之明膠(biotinylated gelatin；BG)濃度。將含有0.05％之NaN3的BG分成數(shù)份，并儲(chǔ)存在4℃下。在微量滴定盤中分析明膠酶MMP-2樣品的明膠酶活性是以下述之程序分析。在此分析程序的第一部份，將50μL之濃度為32ng/mL的Strapavidin(縮寫成SA，Sigma)之50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)涂布在96孔槽圓底微量滴定盤的每個(gè)孔槽中，然后在4℃下置放過夜。接著，以TBST溶液(含有150mM NaCl的50mM Tris.HCl(pH7.35)及0.05％Tween 20)沖洗該微量滴定盤3次以移除過量的SA。在37℃下使用0.5％牛血清蛋白(bovine serum albumin；BSA)對該SA進(jìn)行2小時(shí)的阻斷(blocking)反應(yīng)后，使用大量TBST溶液沖洗該微量滴定盤3次以除去未反應(yīng)的BSA。
在此分析程序的第二部分，將MMP-2樣品以TTC溶液(由50mM Tris.HCl、1mM CaCl2及0.05％Triton X100緩沖液(pH7.5)所組成)適當(dāng)?shù)叵♂?，然后與同體積之溶解在TTC溶液的400ng/mL之BG在微量滴定盤中混合。MMP-2與BG的混合液靜置在37℃下60分鐘，使BG被MMP-2所分解，并讓完整或降解的BG可與滴定盤中SA之結(jié)合部位結(jié)合。接著以TBST沖洗該滴定盤4次以終止反應(yīng)。
在此分析程序的第三部分，在該滴定盤中加入稀釋的Extravidin-過氧化酶(EV-P，1/5000在TBST溶液中)，在37℃下維持60分鐘，使EV-P可與BG的結(jié)合部位結(jié)合。該滴定盤中每個(gè)孔槽之EV-P加入量為50μL。以TBST溶液沖洗該滴定盤4次，然后每個(gè)孔槽系藉由加100μL的3，3’，5，5’-四甲替聯(lián)苯胺(TMB，EV-P的受質(zhì))以測量EV-P的活性，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。反應(yīng)系藉由在每個(gè)孔槽中加入25μL的2M硫酸終止。
使用微量滴定盤讀取機(jī)(Dynex，MRX)讀取滴定盤在450nm下的吸收值(參考波長為470nm)，發(fā)現(xiàn)450nm下的吸收值會(huì)隨著MMP-2的濃度增加而增加。亦即，增加MMP-2的濃度會(huì)增加BG的水解程度，其結(jié)果顯示在第2圖。在第2圖中，每個(gè)數(shù)據(jù)代表三次測量的平均值。在0.078-5ng/mL的MMP-2酶濃度范圍中，反應(yīng)關(guān)系為線性。因此，MMP-2與BG反應(yīng)后之吸收度應(yīng)該比只有BG之吸收度低3-5倍。在微量滴定盤中篩選MMP-2抑制劑MMP-2抑制劑候選化合物的抑制活性可以用上述「在微量滴定盤中分析明膠酶」的方法進(jìn)行篩選。整個(gè)篩選過程只有第二部分和上述分析程序的第二部分不一樣，其余皆相同。
在此篩選程序的第二部分中，先將MMP-2抑制劑候選化合物溶解于10％乙醇中，使最后的乙醇濃度小于3％。然后將20μL的抑制劑候選化合物與30μL的MMP-2(溶解在TTC溶液中，濃度為150ng/mL)混合，使其在30℃下振蕩10分鐘。再加入50μL稀釋的BG(溶解在TTC溶液中，濃度為400ng/mL)至抑制劑候選化合物與MMP-2的混合溶液中。隨后，在37℃下振蕩60分鐘。再使用TBST溶液沖洗該微量滴定盤以終止反應(yīng)。在草藥萃取物中發(fā)現(xiàn)MMP-2抑制劑在草藥萃取物的HPLC分級(jí)液中尋找MMP-2的可能抑制劑。整個(gè)萃取過程為先清洗所收集到的草藥，再將其干燥。然后加入甲醇至稱過重的草藥中(比例為10/1，體積/重量)，以萃取草藥中成分。此萃取過程包含攪拌混合物、在8000rpm下離心320分鐘并傾倒上清液，且重復(fù)上述之步驟2次。收集上清液，再以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(Heidolph，Laborota 4000)濃縮上清液，直至最后體積約為50mL為止。
開始進(jìn)行分離程序。利用HPLC(Shimadzu)分離100μL濃縮后的上清液。HPLC所用的管柱為填有5μm膠顆粒之TSK Gel ODS 80TM(TOSOH)逆相層析管柱(25cm×4.6mm)。分離溶劑為2次蒸餾水與純乙醇，在96分鐘內(nèi)以0-100％濃度梯度進(jìn)行分離，其中流速為0.75mL/min。
收集每1分鐘的分級(jí)液，然后使用SpeedVac(Savant)使其干燥。每1個(gè)分級(jí)液再利用100μL的10％乙醇加以重新溶解，以進(jìn)行MMP-2抑制劑的篩選。然后把具有MMP-2抑制活性的分級(jí)液收集起來，再利用HPLC進(jìn)行純化，直至其純度大于95％。
在蒲公英的甲醇粗萃取液中，利用上述方法篩選到1個(gè)具有抑制MMP-2活性之化合物。第3A圖顯示蒲公英的甲醇粗萃取液的HPLC層析圖譜。該蒲公英的甲醇粗萃取液系以填有5μm膠顆粒之TSK Gel ODS 80TM(TOSOH)逆相層析管柱(25cm×4.6mm)分離成多個(gè)分級(jí)液。HPLC所用的流洗溶劑(eluent)為水(A)與無水乙醇(B；Merck)的混合液，其流速為0.75mL/min。層析管柱系以下列溶劑流洗最初5分鐘為0％B，接著55分鐘為0-30％B的線性梯度，接著20分鐘為30-70％B的線性梯度，接著35分鐘為70-100％B的線性梯度，接著10分鐘為100％B，最后1分鐘為100-0％B的線性梯度。HPLC的UV偵測器系在254nm下進(jìn)行偵測，其偵測靈敏度為0.01 AUFS。
第3B圖顯示自蒲公英的甲醇粗萃取液中分離出具有MMP-2抑制活性的分級(jí)液之層析圖譜。具有MMP-2抑制活性的分級(jí)液系以填有5μm膠顆粒之TSK GelODS 80TM(TOSOH)逆相層析管柱(25cm×4.6mm)進(jìn)行純化。HPLC所用的流洗溶劑為水(A)與無水乙醇(B；Merck)的混合液，其流速為0.75mL/min。層析管柱系以下列溶劑流洗最初12分鐘為0-2％B，接著8分鐘為2-100％B的線性梯度，接著5分鐘為100％B的線性梯度，最后1分鐘為100-0％B的線性梯度。具有MMP-2抑制活性的分級(jí)液之流洗曲線為曲線A，而只有流洗溶劑的流洗曲線為曲線B。HPLC的UV偵測器系在260nm下進(jìn)行偵測，其偵測靈敏度為0.01 AUFS。
經(jīng)純化之MMP-2抑制劑經(jīng)鑒定為1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮(簡稱化合物1)，其分子量為258。用于鑒定的光譜包括質(zhì)譜(Finnigan Trace MS)、富利葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜(Shimadzu；FTIR-8400)、一維核磁共振光譜(Bruker；300MHz；13C NMRδ(ppm)＝166.2(C-7)、152.4(C-9)、142.7(C-11)、102.6(C-10)、90.6(C-5)、86.3(C-2)、75.7(C-4)、71.3(C-3)、62.2(C-15)、及49.4(C-14)；1H NMRδ(ppm)＝8.02(1H、d、H-11)、5.90(1H、d、H-2)、5.70(1H、d、H-10)、4.18(1H、m、H-3)、4.15(1H、m、H-4)、4.00(1H、m、H-5)、3.72(2H、m、H-15))以及二維核磁共振光譜(Varian；Inova-600 MHz)。 化合物1化合物1對MMP-2活性的抑制作用化合物1對MMP-2的抑制功效基本上是利用上述「在微量滴定盤中分析明膠酶」的方法進(jìn)行測量。因?yàn)榛衔?和尿嘧啶核苷(uridine)的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，所以亦將尿嘧啶核苷作為對照組以進(jìn)行測量。所使用的尿嘧啶核苷(D-核糖)系購自Sigma，批號(hào)為3750，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 尿嘧啶核苷在96孔槽圓底微量滴定盤中加入溶解于50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中濃度為32ng/mL的strapavidin(SA)，并令其在4℃下靜置過夜。然后利用TBST沖洗該微量滴定盤3次以除去過量的SA，再以0.5％牛血清蛋白在37℃下對該SA進(jìn)行1小時(shí)的阻斷反應(yīng)，然后利用大量TBST溶液沖洗該微量滴定盤3次以除去未反應(yīng)的BSA。
將化合物1溶解于水中，再藉由TTC溶液稀釋至1mM。進(jìn)一步將化合物1的溶液進(jìn)行系列稀釋至不同之濃度。將0.6ng/mL的MMP-2加入至化合物1的溶液中，其混合之體積比例為3∶2。當(dāng)該混合液于37℃下以500rpm振蕩10分鐘后，加入50μL的BG(溶解在TTC溶液中，濃度為400ng/mL)至MMP-2與化合物1的混合液中。隨后將MMP-2與化合物1的混合液置于37℃下1小時(shí)，再將其加入至已覆蓋有SA的微量滴定盤中，其中每個(gè)孔槽之加入量為50μL。反應(yīng)進(jìn)行1小時(shí)，再以TBST溶液沖洗該滴定盤4次以終止反應(yīng)。
對該滴定盤加入稀釋之Extravidin-過氧化酶(EV-P，1/5000在TBST溶液中)，在37℃下維持60分鐘，其中滴定盤中每個(gè)孔槽之EV-P加入量為50μL。經(jīng)過大量TBST溶液沖洗4次后，每個(gè)孔槽加入100μLTMB以測量EV-P的活性，其中反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。反應(yīng)系利用對每個(gè)孔槽加入25μL的2M硫酸終止，再使用微量滴定盤讀取機(jī)(Dynex，MRX)讀取滴定盤在450nm下的吸收值(參考波長為470nm)。
第4圖顯示化合物1的劑量與抑制MMP-2的效果間的關(guān)系。從圖中計(jì)算出50％抑制效果(IC50)的劑量為150μM。然而，濃度高達(dá)0.82mM之尿嘧啶核苷對MMP-2卻完全沒有抑制功效(數(shù)據(jù)未提供)。增生實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所用之癌細(xì)胞系增生(proliferation)實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞毒性(cytotoxicity)實(shí)驗(yàn)所用之癌細(xì)胞系是得自American Type Culture Collection(ATCC)之5種癌細(xì)胞衍生之細(xì)胞系。該等細(xì)胞系系如下所述1.ES-2為人類卵巢癌細(xì)胞。在McCoy’s 5A基質(zhì)(Gibco)中培養(yǎng)并供給10％胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)以維持。
2.COLO205為自人類結(jié)腸癌衍生之細(xì)胞系。在RPMI 1640基質(zhì)(Hyclone)中培養(yǎng)并以熱處理過的10％胎牛血清維持。
3.PC-3為人類前列腺癌衍生之細(xì)胞系。在Ha’s F12 K基質(zhì)(Gibco)中培養(yǎng)，并供給7％胎牛血清以維持。
4.A375為人類黑色素腫瘤(malignant melanoma)衍生之細(xì)胞系。在Dulbecco’s修飾之Eagle’s基質(zhì)(DMEM，Hyclone)中培養(yǎng)，并供給10％胎牛血清、4mM L-麩胺酸(L-glutamine)、4.5g/L葡萄糖及1.0mM丙酮酸鈉(sodiumpyruvate)以維持。
5.A549為人類肺癌衍生之細(xì)胞系。在Ham’s F12 K基質(zhì)(Gibco)中培養(yǎng)，并供給10％胎牛血清以維持。化合物1對活體外癌細(xì)胞增生之影響使用上述之ES-2、COLO205、PC-3、A375及A549細(xì)胞系測試化合物1與尿嘧啶核苷的細(xì)胞毒性。在微量滴定盤(Falcon，MicroTestTM96)之每個(gè)孔槽的完全基質(zhì)(complete medium)中，加入濃度為1×104細(xì)胞/100μl之不同癌細(xì)胞系，然后使其暴露在不同濃度的化合物1、尿嘧啶核苷或1μM的紫杉醇(paclitaxel)(taxol；Sigma)下約72小時(shí)?；衔?與尿嘧啶核苷的濃度為起始濃度0.258mg/mL之系列兩次稀釋。
細(xì)胞存活力(viability)是使用四唑鎓染料還原分析法(XTT分析；BoehringerMannheim)進(jìn)行分析。對每個(gè)孔槽中加入100μL之XTT試劑(四唑鎓鹽)，其濃度為1mg/mL，然后使其與細(xì)胞反應(yīng)4小時(shí)，其中活細(xì)胞和XTT試劑反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生顏色。測量在450nm下之吸收度，參考波長為690nm?；诎┘?xì)胞有聚集增生的特性，因此所有的存活細(xì)胞都已被有效地增生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1與尿嘧啶核苷并不會(huì)降低細(xì)胞的存活力。因此，化合物1與尿嘧啶核苷在活體內(nèi)并不會(huì)抑制細(xì)胞的增生(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，對細(xì)胞增生的抑制效果卻與紫杉醇的濃度成正比，但其對不同之癌細(xì)胞系具有不同的抑制效果。化合物1對癌細(xì)胞之穿透力與轉(zhuǎn)移力的影響在此分析程序中，使用Boyden化學(xué)趨性分析室(Boyden chemotaxis assaychamber；Costar Transwell plates)。每個(gè)Boyden化學(xué)趨性分析室包含1個(gè)上室(top chamber)與1個(gè)圍繞在上室周圍的底部孔槽(bottom well)，其中上室的底部為濾膜(filter)。所使用的濾膜為具有8μM孔洞的聚碳酸酯薄膜。
在每個(gè)底部孔槽中加入0.35mL的完全營養(yǎng)補(bǔ)充品以作為細(xì)胞的化學(xué)吸引劑。將50μL的癌細(xì)胞(含有2×105個(gè)癌細(xì)胞)涂抹在每個(gè)上室的濾膜上。然后將化合物1或尿嘧啶核苷溶解于沒有血清的基質(zhì)中，使其濃度為0.536mg/mL，再將50μL之化合物1或尿嘧啶核苷溶液加入至每個(gè)上室中。對照組則為上室加入2μM的紫杉醇(正向控制)或培養(yǎng)基(負(fù)向控制)。
經(jīng)靜置18小時(shí)后，上室的細(xì)胞系小心地以消毒后的棉花團(tuán)清除掉。然后在每個(gè)底部孔槽中加入100μL的XTT試劑。經(jīng)靜置4小時(shí)后，測量在450nm下的吸收度，其參考波長為690nm。試驗(yàn)組與對照組的底部孔槽之吸收度的比例系作為癌細(xì)胞穿透力(invasive activity)的指針。所有的結(jié)果皆得自于至少3次的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
第5圖顯示化合物1對ES-2細(xì)胞系之穿透力的影響?；衔?對不同癌細(xì)胞系之穿透力系顯現(xiàn)不同的抑制效果，其中對ES-2細(xì)胞系的影響最大。對ES-2細(xì)胞系可達(dá)到50％抑制效果的劑量為23μg/mL(即0.09μM)。對其他4種癌細(xì)胞系，在與測試ES-2所用之化合物1的相同濃度范圍內(nèi)，其所受之影響不大(未顯示數(shù)據(jù))。而尿嘧啶核苷對該5種癌細(xì)胞系之穿透力皆無影響(未顯示數(shù)據(jù))。化合物1抑制MMP-2之結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系Peter D，Brown等人與G.Clemens等人曾討論過好幾個(gè)MMP抑制劑的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(Clendeninn，NJ and Appelt K(2001)Matrix Metallopoteinase inhibtiors inCancer Therapy.Humana Press Inc.NJ；Chapter 5，PP.113-142；Chapter 7，pp.175-192)。所討論過的MMP抑制劑系例如異羥肟酸(hydroxamic acid)與4-聯(lián)苯丙酸(4-biphenoyl propionic acid)，并發(fā)現(xiàn)1個(gè)分子若要能成為MMP的有效抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)必須要有可以熬合至位在MMP活性中心之Zn(II)離子的官能基，例如羧酸(carboxylic acid)、異羥肟酸或硫醇(sulfhydryl)等官能基。此外，要成為MMP有效抑制劑之分子化學(xué)結(jié)構(gòu)還需要含有至少1個(gè)官能基(可以與酶肽鏈骨干形成氫鍵)，以及至少一個(gè)側(cè)鏈(可以與酶的其它部位(subsites)進(jìn)行凡得瓦(Van der Waals)力的交互作用)。
將化合物1的化學(xué)結(jié)構(gòu)與上述之化學(xué)結(jié)構(gòu)的要求做比較，發(fā)現(xiàn)在其羥基乙基上之羥基應(yīng)為負(fù)責(zé)螯合MMP-2活性中心的Zn(II)?；衔?之嘧啶部分可以與MMP-2之其它疏水性部位形成凡得瓦力的交互作用，而化合物1的氧與氮?jiǎng)t可與MMP-2肽鏈骨干形成氫鍵。
因此，可以合理地將化合物1之羥基乙基轉(zhuǎn)換為其它可以熬合MMP-2酵素活性中心的Zn(II)之官能基。該其它可螯合之官能基系諸如-(CH2)nOH(n＝2-5)、-(CH2)nNH2(n＝2-5)、-(CH2)nSH(n＝2-5)、-(CH2)nCOOH(n＝1-4)、-(CH2)nCOOR(n＝1-4，R＝-CmH2m+1或芳基，m＝1-6)、-(CH2)nCONH2(n＝1-4)、-(CH2)nCONH-OH(n＝1-3)、-(CH2)nCONH-R(n＝1-3，R＝-CmH2m+1或芳基，m＝1-6)或-(CH2)nO(PO3)m(m+1)-(n＝2-3，m＝1-3)。化合物1對TNFα與TNFα-RI結(jié)合之影響加入50μL的TNFα-RI(溶解于50mM的碳酸鹽緩沖液，pH9.5中，TNFα-RI濃度為0.25μg/mL)至96孔槽圓底微量滴定盤(Nunc)之每個(gè)孔槽中，將其靜置于4℃下過夜。使用200μL之TBST溶液清洗該滴定盤，以移去多余的TNFα-RI。在每個(gè)孔槽中加入200μL溶于PBS緩沖液的0.5％BSA溶液，以進(jìn)行TNFα-RI之阻斷反應(yīng)。該阻斷反應(yīng)系在37℃下進(jìn)行2小時(shí)。再以TBST溶液清洗該滴定盤4次，以除去過量的BSA。
化合物1以TBST溶液進(jìn)行系列稀釋。將濃度為0.5μg/mL以生物素標(biāo)記的TNFα與化合物1的溶液相混合，其混合體積比例為1∶1(37℃和00rpm的轉(zhuǎn)速下振震蕩反應(yīng)30分鐘)。再將混合液加入至表面附著有TNFα-RI的滴定盤中，每個(gè)孔槽之加入量為50μL。將滴定盤在37℃和500rpm的轉(zhuǎn)速下振蕩2小時(shí)，使經(jīng)生物素標(biāo)記的TNFα與化合物1競爭結(jié)合至TNFα-RI。
接著以TBST溶液沖洗該滴定盤4次，加入稀釋于TBST溶液中之Extravidin-堿性磷酸酶(Extravidin-Alkaline phosphatase；Sigma；濃度為1/5000)，每個(gè)孔槽之加入量為50μL。該滴定盤再靜置于37℃下2小時(shí)，再以TBST溶液清洗該滴定盤4次。加入對-硝基苯磷酸(P-nitrophenyl phosphate)至滴定盤中。對-硝基苯磷酸為堿性磷酸酶的受質(zhì)，其系溶解在含有5mM氯化鎂之50mM的碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中，濃度為1mg/mL。經(jīng)于室溫下靜置30分鐘后，測量波長405nm下的吸收度。另外，使用蘇拉明(Suramin；一種已知抑制TNFα與TNFα-RI結(jié)合之抑制劑)作為對照組。
第6圖顯示化合物1對抑制TNFα與TNFα-RI結(jié)合之抑制效果。每個(gè)數(shù)據(jù)為3次測量的平均值。第6圖顯現(xiàn)隨著化合物1的濃度增加而使其對控制TNFα與TNFα-RI結(jié)合之抑制效果增加，雖然其抑制效果仍小于蘇明拉。因此，化合物1對于TNFα與TNFα-RI之結(jié)合具有抑制效果，且其達(dá)到50％抑制效果的劑量為50μM。
由上述本發(fā)明之較佳體系可知，化合物1對于MMP-2的活性與TNFα與TNFα-RI之結(jié)合皆具有抑制效果，因此，化合物1可應(yīng)用在與MMP-2及TNFα與TNFα-RI結(jié)合有關(guān)之各種疾病的治療上?；衔?之衍生物，如在「化合物1抑制MMP-2之結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系」中所討論者，對MMP-2亦有抑制之效果。
雖然本發(fā)明已以較佳體系加以揭露，然其并非用于限定本發(fā)明。任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各種之更動(dòng)與修改。因此，本發(fā)明之保護(hù)范圍當(dāng)視后附之申請專利范圍所界定者為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種治療哺乳動(dòng)物與MMP相關(guān)之病癥的方法，其包含投服至該哺乳動(dòng)物治療上有效量之MMP活性的抑制劑，其中該抑制劑是下述通式(I)之化合物 其中X是Zn(II)螯合基且選自(CH2)nOH，(CH2)nNH2，(CH2)nSH，(CH2)mCOOH，(CH2)mCOOR，(CH2)mCONH2，(CH2)m”CONH-OH，(CH2)m”CONH-R，或(CH2)n’O(PO3)m”(m”+1)，其中n是2，3，4或5，n’是2或3，m是1，2，3或4，m’是1，2，3，4，5或6，m”是1，2或3，且R是Cm’H2m’+1或芳基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該化合物是1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該MMP是明膠酶。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中該明膠酶是明膠酶A(MMP-2)。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該病癥是卵巢癌。
6.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
7.一種治療哺乳動(dòng)物與TNFα相關(guān)之病癥的方法，其包含投服至該哺乳動(dòng)物治療上有效量之抑制TNFα與TNFα-RI受體結(jié)合的抑制劑，其中該抑制劑是下述通式(I)之化合物 其中X是Zn(II)螯合基且選自(CH2)nOH，(CH2)nNH2，(CH2)nSH，(CH2)mCOOH，(CH2)mCOOR，(CH2)mCONH2，(CH2)m”CONH-OH，(CH2)m”CONH-R，或(CH2)n’O(PO3)m”(m”+1)，其中n是2，3，4或5，n’是2或3，m是1，2，3或4，m’是1，2，3，4，5或6，m”是1，2或3，且R是Cm’H2m’+1或芳基。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該化合物是1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中該病癥是卵巢癌。
10.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
11.一種同時(shí)治療哺乳動(dòng)物之與MMP相關(guān)之病癥及與TNFα相關(guān)之病癥的方法，其包含投服至該哺乳動(dòng)物治療上有效量之抑制MMP活性和抑制TNFα與TNFα-RI受體結(jié)合的抑制劑，其中該抑制劑是下述通式(I)之化合物 其中X是Zn(II)螯合基且選自(CH2)nOH，(CH2)nNH2，(CH2)nSH，(CH2)mCOOH，(CH2)mCOOR，(CH2)mCONH2，(CH2)m”CONH-OH，(CH2)m”CONH-R，或(CH2)n’O(PO3)m”(m”+1)，其中n是2，3，4或5，n’是2或3，m是1，2，3或4，m’是1，2，3，4，5或6，m”是1，2或3，且R是Cm’H2m’+1或芳基。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中該化合物是1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中該MMP是明膠酶。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中該明膠酶是明膠酶A(MMP-2)。
15.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中該病癥是卵巢癌。
16.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
17.一種治療哺乳動(dòng)物與MMP相關(guān)之病癥的藥物組合物，其包含有效量之下述通式(I)之化合物 其中X是Zn(II)螯合基且是選自(CH2)nOH，(CH2)nNH2，(CH2)nSH，(CH2)mCOOH，(CH2)mCOOR，(CH2)mCONH2，(CH2)m”CONH-OH，(CH2)m”CONH-R，或(CH2)n’O(PO3)m”(m”+1)，其中n是2，3，4或5，n’是2或3，m是1，2，3或4，m’是1，2，3，4，5或6，m”是1，2或3，且R是Cm’H2m’+1或芳基，及適宜之藥學(xué)賦形劑。
18.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其中該化合物是1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
19.如權(quán)利要求17或18所述的藥物組合物，其中該MMP是明膠酶。
20.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中該明膠酶是明膠酶A(MMP-2)。
21.如權(quán)利要求17或18所述的藥物組合物，其中該病癥是卵巢癌。
22.如權(quán)利要求17或18所述的藥物組合物，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
23.一種治療哺乳動(dòng)物與TNFα相關(guān)之病癥的藥物組合物，其包含有效量之下述通式(I)之化合物 其中X是Zn(II)螯合基且選自(CH2)nOH，(CH2)nNH2，(CH2)nSH，(CH2)mCOOH，(CH2)mCOOR，(CH2)mCONH2，(CH2)m”CONH-OH，(CH2)m”CONH-R，或(CH2)n’O(PO3)m”(m”+1)，其中n是2，3，4或5，n’是2或3，m是1，2，3或4，m’是1，2，3，4，5或6，m”是1，2或3，且R是Cm’H2m’+1或芳基，及適宜之藥學(xué)賦形劑。
24.如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中該化合物是1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
25.如權(quán)利要求23或24所述的藥物組合物，其中該病癥是卵巢癌。
26.如權(quán)利要求23或24所述的藥物組合物，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
27.一種同時(shí)治療哺乳動(dòng)物之與MMP相關(guān)之病癥及與TNFα相關(guān)之病癥的藥物組合物，其包含有效量之下述通式(I)之化合物 其中X是Zn(II)螯合基且選自(CH2)nOH，(CH2)nNH2，(CH2)nSH，(CH2)mCOOH，(CH2)mCOOR，(CH2)mCONH2，(CH2)m”CONH-OH，(CH2)m”CONH-R，或(CH2)n’O(PO3)m”(m”+1)，其中n是2，3，4或5，n’是2或3，m是1，2，3或4，m’是1，2，3，4，5或6，m”是1，2或3，且R是Cm’H2m’+1或芳基，及適宜之藥學(xué)賦形劑。
28.如權(quán)利要求27所述的藥物組合物，其中該化合物是1-[3，4-二羥基-5-(2-羥基乙基)四氫呋喃-2-基]嘧啶-2，4(1H，3H)-二酮。
29.如權(quán)利要求27或28所述的藥物組合物，其中該MMP是明膠酶。
30.如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中該明膠酶是明膠酶A(MMP-2)。
31.如權(quán)利要求27或28所述的藥物組合物，其中該病癥是卵巢癌。
32.如權(quán)利要求27或28所述的藥物組合物，其中該哺乳動(dòng)物是人類。
全文摘要
本發(fā)明揭示治療和預(yù)防與TNFα相關(guān)之病癥和與MMP相關(guān)之病癥的方法，及供該治療使用之化合物類。特定言之，本發(fā)明揭示含有下述通式之化合物的藥物組合物其中X是Zn(II)螫合基且選自(CH
文檔編號(hào)A61P31/04GK1440751SQ0310665
公開日2003年9月10日 申請日期2003年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月25日
發(fā)明者徐立偉, 張素真, 李政偉, 劉邦熙, 李慧萍, 陳怡菁, 陳俊村 申請人:先進(jìn)基因股份有限公司