專利名稱：一種利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，屬于表面科學(xué) 和生物醫(yī)用高分子材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因治療被認為是各種基因疾病(包括傳染病、癌癥等)治療的有效途徑。基因 治療過程中，必須用基因載體(包括病毒載體和非病毒載體)將核酸藥物輸送到病灶部位。 前者是高轉(zhuǎn)染效率載體，但是免疫反應(yīng)、基因突變限制了其應(yīng)用。因此，人們越來越關(guān)注安 全、低毒性的非病毒載體，其中聚陽離子基因載體是近些年來的研究熱點之一。在實際的應(yīng)用中，聚陽離子非病毒基因載體也存在著一定的問題。具體的說，聚陽 離子與DNA形成的復(fù)合物表面帶有部分的正電荷，在體內(nèi)循環(huán)中容易吸附蛋白，繼而引發(fā) 血小板、細胞黏附，導(dǎo)致形成血栓、免疫反應(yīng)。因此，將具有抑制非特異性吸附能力、良好生 物相容性的聚乙二醇(PEG)應(yīng)用于陽離子基因載體表面改性，成為近些年來研究的重點。 然而，與該聚陽離子相比，PEG修飾后聚陽離子的轉(zhuǎn)染率有所降低(高分子學(xué)報，2009，6， 499-505 ；Biomaterials,2009,30(34) :6655_6664)。磷酰膽堿(Phosphorycholine，PC)是生物細胞外層膜的主要成份，是細胞外層膜 中的外層官能團，是組成細胞膜基本單元卵磷脂的親水端基。從結(jié)構(gòu)來看，磷酰膽堿帶有兩 性離子端基，同時帶有正、負兩種電荷，因而具有很強的結(jié)合水的能力。這種性質(zhì)使富含磷 酰膽堿基團的材料表面不易吸附及沉集蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體等生物體成分，表現(xiàn)出良好的生物 相容性。日本和英國的研究小組(Biomaterials, 2009, 30 (28) 4930-4938 ；Biomaterials, 2004,25(19) 4785-96)在對含有陽離子、中性、陰離子的磷酰膽堿聚合物的表面進行蛋白 質(zhì)吸附、細胞粘附研究。結(jié)果表明帶有靜電荷磷酰膽堿類聚合物均可以用于改善材料的血 液相容性。因此，利用含有磷酰膽堿及其衍生物在聚陽離子材料表面構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié) 構(gòu)具有重要的理論意義和巨大的應(yīng)用前景。國內(nèi)外學(xué)者采用接枝含磷酰膽堿基團小分子的方法改性殼聚糖，使其生物相容 性，特別是血液相容性得到明顯的改善(Carbohydrate Polymers, 2007, 70 (1) :82_88 ； ZL 200410054022. 2 Journal of Applied Polymer Science,2003,88(2) 489-493 ； Polymer International,2003, 52(1) 81-85 ；Journal ofbiomaterials science,Polymer edition,2002,13(5) 501-510 ；Colloids andSurfaces B =Biointerfaces,2009,71(2) 268-274 ；Applied Surface Science, 2008，255 (2) =538-540) 然而，接枝方法較難獲得富 含磷酰膽堿基團表面，同時也限制了進一步提高生物相容性，而且接枝改性受設(shè)備，基材組 成、形狀等條件的影響，限制了在生物材料表面改性領(lǐng)域的應(yīng)用(LangmUir，2009，25(6) 3610-3617 ；Science,1997,277(5330) 1232-1237 ；Biomacromolecules,2009, 10(8) 2275-2283 ；Biomacromolecules, 2007,8 (10) :3169_3176)。通過靜電相互作用的靜電自組 裝方法，在帶電表面吸附上帶異種電荷的聚電解質(zhì)，條件簡單，適應(yīng)性強，已成為生物醫(yī)用 材料表面改性行之有效的手段。
為了降低聚電解質(zhì)多層膜非特異性蛋白吸附和細胞黏附，Andreas Reisch等 人(Langmuir，2009，25(6) 3610-3617)將含有磷酰膽堿基團丙烯酰胺類單體的聚合物通 過靜電相互作用吸附到 PSS/PAH(PSS，poly(styrenesulfonate) ；PAH, poly (allylamine hydrochloride))表面，顯著改善了聚電解質(zhì)多層膜的生物相容性。加拿大的科研小組將 含有醛基磷酰膽堿的分子接枝改性殼聚糖(235th ACS National Meeting, United States 2008,6-10 ；Biomacromolecules,2007,8(10)，3169-3176 ；Biomacromolecules,2006, 7(11) 3151-3156 Journal ofColloid and Interface Science,2009，336 (1) :125_133)， 然后將改性后的殼聚糖和透明質(zhì)酸通過多層聚電解質(zhì)沉積技術(shù)層層自組裝，提高了涂層 的血液相容性。磷酰膽堿改性的殼聚糖可以和DNA復(fù)合形成納米顆粒用于基因治療。同 樣，將帶有負電荷聚乙二醇通過靜電相互作用自組裝在聚乙烯亞胺/DNA納米顆?；蜉d 體表面可以提高基因的轉(zhuǎn)染率(Biomacromolecules, doi 10. 1021/bml002569)，開拓了 基因控釋的新方向。劉建平等人(中國專利申請CN 200710047123.0 ；中國專利申請CN 200710047124. 5)將絲素肽和幾丁糖利用靜電層層自組裝吸附在血管支架表面。與未改性 的血管支架相比，改性后的材料表面具有良好的血液相容性，可以降低支架術(shù)后心臟血管 晚期再狹窄率。計劍等人(中國專利申請CN 03116748. 9)采用表面改性方法在生物材料表 面獲得具有正電荷或負電荷的表面，通過靜電相互作用將帶電抗凝血藥物(白蛋白、肝素、 磺化葡聚糖、尿激酶、聚苯乙烯磺酸鈉)和帶異種電荷的聚電解質(zhì)層層自組裝，改善材料的 抗凝血性。高長有等人(中國專利申請CN200510061354.8)通過在微膠囊表面引入接枝有 聚乙二醇的聚電解質(zhì)，提高微膠囊的生物相容性，避免體內(nèi)的組織的不良反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)改善聚陽離子材料表面血 液相容性的方法。將含有兩性離子親水性基團的聚陰離子二元共聚物，通過靜電相互作用 吸附在帶正電荷的聚陽離子材料表面，形成仿細胞膜外層結(jié)構(gòu)，達到對材料表面改性的目 的。本發(fā)明的實現(xiàn)過程一種利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，具體如下將聚陰離子二 元共聚物通過靜電相互作用吸附在聚陽離子材料表面，在聚陽離子材料表面形成仿細胞外 層膜結(jié)構(gòu)。所述的聚陰離子二元共聚物為含有兩性離子親水性基團的隨機共聚物或嵌段共 聚物，兩性離子親水性基團為帶有磷酰膽堿基團、磺銨類或羧銨類的丙烯酸類單體。聚陰離子二元共聚物中陰離子基團為羧酸基、磺酸基、硫酸基或磷酸基，聚陰離子 二元共聚物中陰離子單體占聚合物單體摩爾百分含量為50 90%。所述的聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸或樹枝狀聚氨酯。更優(yōu)選的方案是，聚陽離子材料為殼聚糖，聚陰離子二元共聚物為甲基丙烯 酸-甲基丙烯酰氧乙基磷酰膽堿二元共聚物，殼聚糖鏈上的氨基通過靜電相互作用吸附帶 負電荷含有磷酰膽堿基團的二元聚合物上的羧基，在其表面自動構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)， 形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，聚電解質(zhì)復(fù)合物是納米顆粒、水凝膠、微膠囊及膜形態(tài)。在殼聚糖表面通過靜電自組裝的原理吸附甲基丙烯酸-甲基丙烯酰氧乙基磷酰
4膽堿二元共聚物(MA-C0-MPC，PMA)構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)。PMA是一種陰離子的聚電解質(zhì)， 帶有磷酰膽堿兩性離子側(cè)基，適用于對殼聚糖及其它聚陽離子材料表面進行仿細胞外層膜 結(jié)構(gòu)的修飾。PMA中的陰離子羧酸根可通過靜電相互作用而吸附氨基或帶正電荷的聚陽離 子，所以可用于在含有氨基及其它聚陽離子材料表面構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)。殼聚糖膜的制備參考文獻(ColloidsandSurfaces B =Biointerfaces, 2009, 71(2) :268-274 ；中國專利申請CN 200910020872. 3)用1% (V/V)的醋酸溶解一定量的殼 聚糖，得到0. 1 0. 8wt%的殼聚糖溶液。上述的殼聚糖溶液過濾、靜置脫泡后，將固體基材 如載玻片豎直浸入殼聚糖溶液，然后緩慢提出?；纳贤扛驳臍ぞ厶悄ぴ谑覝叵铝栏珊螅?泡于0. 5襯％的氫氧化鈉溶液1 1. 5h，之后用二次蒸餾水充分浸泡，直到洗滌水的電導(dǎo)率 與蒸餾水相當為止，最后30°C真空干燥。靜電自組裝過程如下將殼聚糖膜豎直浸入PMA的NaCl水溶液中，吸附 10-30min。之后，將樣片取出，依次NaCl水溶液、蒸餾水小心淋洗，冷凍干燥，即可得到PMA 靜電自組裝改性殼聚糖膜。本發(fā)明將含有兩性離子、陰離子的丙烯酸類單體的二元共聚物作為聚陰離子，與 聚陽離子通過靜電自組裝在聚陽離子材料表面構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)。聚陰離子二元共聚 物通過靜電相互作用吸附在聚陽離子表面，條件簡單，適應(yīng)性強，可實現(xiàn)對具有復(fù)雜體型結(jié) 構(gòu)的聚陽離子材料表面修飾。與聚陽離子材料相比，改性后的表面對蛋白吸附、血小板黏附 明顯降低，血液相容性顯著提高。


圖1.為涂覆殼聚糖膜(CS，a)和經(jīng)過改性后殼聚糖膜(CS-PMA，b)表面血小板黏 附形貌圖；圖2.為鹽對改性涂層動態(tài)接觸角的影響；圖3.為殼聚糖膜(CS)和經(jīng)過改性后殼聚糖膜(CS-PMA)涂層在PBS (pH = 7. 4)
穩(wěn)定性。
具體實施例方式MPC 單體可按文獻報道的方法(Polymer Journal, 1990，22 (5) :355_360 ； Makromolekulare Chemie,Rapid Communications, 1982, 3 (7) :457_459)合成。甲基丙烯酸 (MA)等，均可從國內(nèi)生產(chǎn)公司購買或Sigma公司購買。甲基丙烯酸-甲基丙烯酰氧乙基磷 酰膽堿二元共聚物(MA-co-MPC，PMA)可參考文獻報道的方法(Biomacromolecules，2002， 3(1) 100-105 ；Biomaterials, 2010, 31 (14) 4009-4016)合成。利用動態(tài)接觸角測試儀(DCA)、X_射線光電子能譜(XPS)、原子力顯微鏡(AFM)分 別對改性前后的殼聚糖膜動態(tài)接觸角、表面元素組成、形貌進行表征。前進角從改性前的 84. 0 士 2. 5降低到48. 7 士 0. 6，后退角由11. 4 士 0. 6降低到6. 5 士 0. 3 ；改性后表面磷摩爾含 量為3. 23%;改性前后形貌有所不同，均說明殼聚糖表面通過靜電自組裝獲得仿細胞外層 膜結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)吸附實驗參照文獻(Biomacromolecules，2009，10(2) :267_274·)方法進 行。分別用緩沖液(PH = 7. 4)溶解一定量的牛血清白蛋白(BSA)和纖維蛋白原(Fg)，得到一定濃度的蛋白溶液。將樣品在PBS緩沖溶液中平衡lh，小心的將樣品表面的緩沖液擦拭 干凈，之后將樣品轉(zhuǎn)移到吸附容器中，加入一定量的BSA和Fg蛋白溶液，37°C孵育2h。孵育 結(jié)束后，解吸附在材料表面吸附的蛋白，采用微量BCA法計算樣品表面吸附的蛋白含量。血小板黏附實驗參照文獻(Biomaterials，2007，28(10) :1752_1760·)方法進行。 樣品在PBS緩沖溶液中平衡2h，小心的將樣品表面的緩沖液擦拭干凈，之后取富含血小板 的血漿(PRP，Platelet-rich plasma) 20 μ L滴加到樣品片上，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2h。培養(yǎng)結(jié)束后，將樣品片浸泡入2. 5%的戊二醛溶液中進行固定lh。將固定好的樣品片 依次用PBS、蒸餾水沖洗，冷凍干燥。樣品片冷凍干燥后，用掃描電鏡(SEM)觀察，血小板黏 附后的材料表面形貌。實施例1 將0. 5g殼聚糖溶于100mL，l%醋酸水溶液中，室溫條件下攪拌24小時。殼聚糖溶 解后，用砂心漏斗過濾，靜置30min消除氣泡。待氣泡消除后，采用浸涂方式在載玻片上涂 覆殼聚糖膜，將其在室溫條件下晾置24小時。殼聚糖膜晾干后，將其置于0. 的氫氧化鈉 的溶液浸泡1小時，之后，用蒸餾水浸泡，每隔4-5h換一次蒸餾水，累計浸泡48小時。最后 30°C真空干燥8小時，即可得到殼聚糖膜。實施例2 取用上述方法制備的殼聚糖膜，浸泡于20mL，lmg/mL PMA30、PMA50、PMA70水溶 液中(30，50，70分別代表聚合物合成中單體MPC投料占總投單體的百分摩爾含量)，吸附 15min，然后用蒸餾水淋洗，冷凍干燥，即可得到改性的殼聚糖膜。與殼聚糖膜相比，改性后 的膜與水接觸的前進角降低20度左右。實施例3 取用上述方法制備的殼聚糖膜，浸泡于20mL，lmg/mL PMA30,0. 14MNaCl水溶液中， 吸附15min，依次用0. 14M NaCl水溶液、蒸餾水淋洗，冷凍干燥，即可得到改性的殼聚糖膜。 與殼聚糖膜相比，改性后的膜對蛋白質(zhì)吸附量明顯降低、血小板沒有聚集僅有少量粘附，血 液相容性顯著提高(圖1)。實施例4:取用上述方法制備的殼聚糖膜，浸泡于20mL，lmg/mL PMA50,0. 14MNaCl水溶液中， 吸附15min，依次用0. 14M NaCl水溶液、蒸餾水淋洗，冷凍干燥，即可得到改性的殼聚糖膜。實施例5 取用上述方法制備的殼聚糖膜，浸泡于20mL，lmg/mL PMA70,0. 14MNaCl水溶液中， 吸附15min，依次用0. 14M NaCl水溶液、蒸餾水淋洗，冷凍干燥，即可得到改性的殼聚糖膜。與實施例2相比，在有鹽條件下PMA30、PMA50、PMA70 (30，50，70分別代表聚合物合 成中單體MPC投料占總投單體的百分摩爾含量)可以得到具有仿細胞膜結(jié)構(gòu)表面與水接觸 的前進角更低(圖2)。將樣品片浸泡于PBS (pH = 7. 4)溶液中一段時間后，用蒸餾水淋洗，冷凍干燥。測 試動態(tài)接觸角，根據(jù)動態(tài)接觸角和表面組成以及表面的親、疏水的關(guān)系，來衡量改性膜前后 的穩(wěn)定性(Applied Surface Science, 2008，255 (2) :538_540)。與 PMA50、PMA70 相比， PMA30改性后的涂層在40天內(nèi)前進角基本不變，涂層穩(wěn)定性較高(圖3)。
權(quán)利要求
一種利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其特征在于將聚陰離子二元共聚物通過靜電相互作用吸附在聚陽離子材料表面，在聚陽離子材料表面形成仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其特征在 于所述的聚陰離子二元共聚物為含有兩性離子親水性基團的隨機共聚物或嵌段共聚物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其特征在 于所述的兩性離子親水性基團為帶有磷酰膽堿基團、磺銨類或羧銨類的丙烯酸類單體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其特征在 于聚陰離子二元共聚物中陰離子基團為羧酸基、磺酸基、硫酸基或磷酸基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其特征在 于聚陰離子二元共聚物中陰離子單體占聚合物單體摩爾百分含量為50 90%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其特征在 于所述的聚陽離子為殼聚糖、聚乙烯亞胺、聚賴氨酸或樹枝狀聚氨酯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任意之一所述的利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方 法，其特征在于聚陽離子材料為殼聚糖，聚陰離子二元共聚物為甲基丙烯酸-甲基丙烯酰 氧乙基磷酰膽堿二元共聚物，殼聚糖鏈上的氨基通過靜電相互作用吸附帶負電荷含有磷酰 膽堿基團的二元聚合物上的羧基，在其表面自動構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)，形成聚電解質(zhì)復(fù) 合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其特征在 于聚電解質(zhì)復(fù)合物是納米顆粒、水凝膠、微膠囊及膜形態(tài)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用靜電自組裝涂層改善材料血液相容性的方法，其方法是將聚陰離子二元共聚物通過靜電相互作用吸附在聚陽離子材料表面，在聚陽離子材料表面形成仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)。本發(fā)明將含有兩性離子、陰離子的丙烯酸類單體的二元共聚物作為聚陰離子，與聚陽離子通過靜電自組裝在聚陽離子材料表面構(gòu)建仿細胞外層膜結(jié)構(gòu)，聚陰離子二元共聚物通過靜電相互作用吸附在聚陽離子表面，條件簡單，適應(yīng)性強，可實現(xiàn)對具有復(fù)雜體型結(jié)構(gòu)的聚陽離子材料表面修飾。與聚陽離子材料相比，改性后的表面對蛋白吸附、血小板黏附明顯降低，血液相容性顯著提高。
文檔編號A61K47/32GK101934080SQ201010275720
公開日2011年1月5日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者宮永寬, 宮銘, 張輝 申請人:西北大學(xué)