專利名稱：弱毒化Vero毒素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種弱毒化的毒素，編碼該毒素的基因、載體、病毒及含該毒素或毒素基因載體的藥物組合物。更具體的說，本發(fā)明提供了一種弱毒化的Vero毒素突變VT2vp1毒素，及編碼該毒素的突變VT2vp1基因，含有該突變基因的載體、病毒和含有該毒素或毒素基因的用于治療細(xì)胞增生性疾病的藥物組合物。
背量技術(shù)Vero毒素是由病原性大腸桿菌的一種腸道出血性大腸桿菌產(chǎn)生的。它是由有毒性的A亞基和與受體結(jié)合的B亞基構(gòu)成的蛋白質(zhì)性外毒素。如今，已發(fā)現(xiàn)的Vero毒素家族有VT1、VT2、VT2vha(VT2variant human a)、VT2 vhb、VT2vp1(VT2 variant porcine 1)和VT2vp2構(gòu)成，其中發(fā)現(xiàn)VT2vp1與豬的浮腫病及人細(xì)胞增生性疾病有關(guān)(參見Linggood，M.A.，和Thompson，J.M.1987.Verotoxin production amongporcine strains of Escherichia coli and its association with edemadisease.J.Med.Microbiol.25359-362)。
Endo等證實(shí)，VT2有RNA的N-糖苷酶活性，能夠切除兔網(wǎng)狀細(xì)胞核糖體60S亞基的構(gòu)成成分28S核糖體RNA的N糖苷鍵，從而抑制蛋白質(zhì)的合成(參見Endo，Y.，等.1988.Site of action of a Verotoxin(VT2)from Escherichia coli O157H7 and of Shiga toxin oneukaryotic ribosomes.Eur.J.Biochem.17145-50)。這些分子的作用機(jī)理和Endo及其同事報(bào)道的植物血凝素、蓖麻毒素是完全一樣的。這些發(fā)現(xiàn)促使許多研究工作者通過比較Vero毒素的A亞基和蓖麻毒素的氨基酸序列，來尋找Vero毒素的酶活性中心。Hovde等第一個證實(shí)了VT1中的E167對于活性的重要性。利用定點(diǎn)突變技術(shù)將E167替換為天門冬氨酸將會降低其蛋白合成的抑制活性、細(xì)胞內(nèi)毒性和鼠致命活性(參見Hovde，C.J等.1988.Evidence that glutamic acid 167 isan active-site residue of Shiga-like toxin I.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.852568-2572)。Yamasaki等構(gòu)建了22個編碼VT1的突變基因，發(fā)現(xiàn)E167Q和R170L能大大降低其生物學(xué)活性(參見Yamasaki，S.等1991.Important of arginine at position 170 of the A subunit of Verotoxin 1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxinactivity.Microb.Pathog.111-9)。Ohmura等進(jìn)一步的構(gòu)建了E167Q-R170L的雙突變體。并檢測純化的突變VT1的活性(參見Endo，Y等.1987.RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain.J.Biol.Chem.2628128-8130)。
在VT2vp1中，Gordon等制備了E167Q、E167D和E167D-R170K，證實(shí)其中的E167Q毒性最低(參見Gordon等.1992.An enzymaticmutant of Shiga-like toxin II variant is a vaccine candidate for edemadisease of swine.Infect Immun.60485-490)。Macleod和Gyles報(bào)道了用戊二醛處理過的VT2vp1來免疫豬取得良好效果(參見Macleod等.1991.Immunization of pigs with a purified Shiga-like toxin II varianttoxoid.Vet.Microbiol.29309-318)。加入用VT2vp1類毒素來免疫能有效的防止豬浮腫的發(fā)生，那么和野生型VT2vp1有同樣和相似抗原屬性的無毒毒素突變體比用化學(xué)處理的類毒素應(yīng)該更適合，因此Gordon等構(gòu)建了VT2vp1的E167Q作為候選疫苗用來預(yù)防和治療細(xì)胞增生性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中，我們通過定點(diǎn)突變VT2vp1基因而獲得弱毒性突變VT2vp1基因和弱毒性的突變毒素，在該毒素中，VT2vp1的A亞基從N末端起第167位點(diǎn)處的glu和170位點(diǎn)處的arg分別被谷氨酸鹽和leu代替。我們發(fā)現(xiàn)雙突變體E167Q-R170L表現(xiàn)出比單突變體E167Q有更低的活性。這個結(jié)果相對于Ohmura等以前所發(fā)現(xiàn)的在VT1中替換兩個氨基酸，E167和R170沒有表現(xiàn)出活性的降低來說是令人驚訝的。這種差異可能是由于VT1和VT1vp1突變體三維結(jié)構(gòu)的不同從而影響了其活性。
在本研究中將構(gòu)建的E167Q-R170L作為類毒素候選疫苗，其中有幾個優(yōu)點(diǎn)(i)它的生物活性低于E167Q，其抑制蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞內(nèi)毒性和鼠致命性分別大約是E167Q的1/2、1/10和1/4，(ii)該三種突變多肽被替換了兩個氨基酸，降低了回復(fù)突變的可能性。
(iii)中和抗E167Q-R170L細(xì)胞內(nèi)毒性的活性與中和抗野生型VT2vp1細(xì)胞內(nèi)毒性的活性相當(dāng)。
通過用VT2vp1特異性bead-ELISA技術(shù)，我們從豬中分離了VT2vp1株，但在人和牛中沒有分離出來，這說明在生產(chǎn)VT2vp1的豬VTEC中存在一種獨(dú)一無二的克隆因子，該克隆因子不能和牛及人的目的細(xì)胞相互作用。如果這個推斷是事實(shí)的話，那么構(gòu)建活的豬浮腫病及人細(xì)胞增生性疾病的口服疫苗是可能的，在該疫苗中，野生型的VT2vp1基因是被編碼E167Q-R170L的基因體外替換。
本發(fā)明的目的是提供一種弱毒化的Vero毒素，具體的說就是提供一種由A亞基從N末端起第167位點(diǎn)處的glu和170位點(diǎn)處的arg分別被谷氨酸鹽和leu代替的突變VT2vp1編碼的Vero毒素；并利用Vero毒素的基因編碼的蛋白質(zhì)合成具有阻礙癌細(xì)胞生長的抗癌劑，更具體的說也就是用病毒載體把弱毒化了的Vero毒素的A亞基或A、B亞基導(dǎo)入進(jìn)癌細(xì)胞，并使其死亡。


圖1是純化的突變VT2vp1毒素與野生型的VT2vp1毒素對兔網(wǎng)狀細(xì)胞球蛋白抑制作用示意圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用的菌株是E.coliO139H1(菌株號為KY010)，是由H.Tanaka從患浮腫病的豬中分離出來，并利用VT2vp1基因的特異性引物進(jìn)行PCR證實(shí)了該菌株中僅僅含有VT2vp1基因。
用PstI、Ecot22I和EcoRI消化E.coli KY010的基因組DNA，在Southern雜交中能與VT2特異性探針發(fā)生陽性反應(yīng)的2.0kb的PstI片斷被克隆到質(zhì)粒pUC119中，制備質(zhì)粒pKTN802，能與VT2特異性探針(含有來自pKTN802質(zhì)粒的A亞基和B亞基的部分基因的0.22kb的HincII/PstI片斷)發(fā)生陽性反應(yīng)的4.3kb的EcoT221/EcoRI片斷被克隆到質(zhì)粒pBR322中，形成質(zhì)粒pKTN808。將pKTN802的1.6kb的PstI/HincII片斷和來自pKTN808的1.0kb的HincII/BamHI片斷連接起來，形成2.6kb的含有VT2vp1基因的片斷，將該片斷再克隆到質(zhì)粒pUC119中，形成質(zhì)粒pKTN817。
根據(jù)以前的描述進(jìn)行多核苷酸的定點(diǎn)突變(參見Yamasaki，S.等1991.Important of arginine at position 170 of the A subunit of Vero toxin1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxinactivity.Microb.Pathog.111-9)。將來自pKTN817的1.9kb的Sau3AI片斷克隆到M13mp18的BamHI位點(diǎn)形成M13mp18.CI。從E.coliCJ236(M13mp18.CI)中分離出單鏈的M13mp18.CI DNA，和突變的多核苷酸退火，在體外進(jìn)行聚合和連接。將獲得的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到載體中，轉(zhuǎn)化獲得的載體顆粒感染E.coli MV1184，分離其中的雙鏈DNA，檢測VT2vp1基因發(fā)生突變的M13mp18.CI衍生物。為了證實(shí)沒有其他的突變產(chǎn)生，將含有突變基因的整個基因利用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列測定。
將M13mp18.CI中用MUTAGENIC OLIGONUCLEOTIDES導(dǎo)入6個含有突變的VT2vp1基因的EcoRI-HindIII片斷，分別克隆到pUC118的EcoRI-HindIII位點(diǎn)，形成pKTC1-pKTC6。再將PKTC1和pKTC2的EcoRV-HincII片斷克隆到pKTN817的EcoRV-HincII位點(diǎn)形成pKTC7和pKTC2d。含有pKTC7、pKTC2d、、pKTC3、pKTC4、pKTC5和pKTC6分別命名為E.coli CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6，這些E.coli菌株生產(chǎn)的突變毒素分別命名為CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6。將含有野生毒素質(zhì)粒的E.coliHB101(pKTN817)和突變毒素E.coli菌株進(jìn)行搖床培養(yǎng)，使突變的VT2vp1s基因表達(dá)。收集細(xì)胞，進(jìn)行超聲波處理，離心混合物，收集上清液，制備毒素的粗樣。最后純化VT2vp1毒素和突變VT2vp1毒素。
優(yōu)選地，純化VT2vp1毒素和突變VT2vp1毒素包括以下步驟使粗樣通過快速流DEAE瓊脂糖凝膠色譜；在PBE118柱上進(jìn)行層析聚焦色譜(Pharmacia，Uppsala，Sweden)和在TSK膠G-2000SW上進(jìn)行的高效液相色譜(HPLC)。
本發(fā)明對純化的突變VT2vp1毒素的生物活性進(jìn)行了測，分別檢測了突變VT2vb1毒素的蛋白質(zhì)合成抑制活性、非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性和鼠致命性，并與純化野生型VT2vp1比較。我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的突變VT2vp1毒素的活性顯著降低，如表1所示。
因此本發(fā)明的突變VT2vp1毒素可以用來作為疫苗，作為預(yù)防或治療細(xì)胞增生性疾病。所以本發(fā)明還包括用于預(yù)防或治療細(xì)胞增生性疾病的藥物組合物，該組合物包含有上述突變的弱毒性VT2vp1毒素蛋白和其他任一種藥用載體、輔助劑或賦形劑?？捎糜诒景l(fā)明藥用組合物中的可藥用載體、輔助劑或賦形劑包括，但不限于，卵磷脂、血清蛋白如人血清蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、山梨酸、梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的部分甘油脂混合物、水、鹽或電解質(zhì)、纖維素基物質(zhì)、聚乙二醇、臘及羊毛脂。
本發(fā)明的藥物組合物可以經(jīng)口、不經(jīng)腸，通過吸入噴霧、局部、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、經(jīng)頰、或經(jīng)由植入的貯器施用。優(yōu)選經(jīng)口使用。本發(fā)明的藥物組合物可以含有任一種常規(guī)的無毒可藥用載體、輔助劑或賦形劑?！安唤?jīng)腸”一詞在本文中包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、胸骨內(nèi)或輸注技術(shù)。
本發(fā)明的藥用組合物可以以任選口服可接受的計(jì)量形式口服施用，包括單不限于，膠囊、藥片、和水懸浮液和溶液。在口服藥片的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。還可典型的加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。對于膠囊形式的口服施用，可用的稀釋劑包括乳糖和干燥的玉米淀粉。當(dāng)水懸浮液口服施用時，活性成分與乳化與懸浮劑組合。如果需要，還可膠乳某些增甜和/或增香和/或著色劑。
為了更全面的了解本發(fā)明，給出以下優(yōu)選實(shí)施例。這些實(shí)施例目的在于說明而非旨在以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1含有VT2vp1基因的質(zhì)粒的構(gòu)建用pstI、Ecot22I和EcoRI消化E.coli KY010的基因組DNA，在Southern雜交中能與VT2特異性探針發(fā)生陽性反應(yīng)的2.0kb的pstI片斷被克隆到質(zhì)粒pUC119中，制備質(zhì)粒pKTN802，能與VT2特異性探針(含有來自pKTN802質(zhì)粒的A亞基和B亞基的部分基因的0.22kb的HincII/PstI片斷)發(fā)生陽性反應(yīng)的4.3kb的EcoT221/EcoRI片斷被克隆到質(zhì)粒pBR322中，形成質(zhì)粒pKTN808。將pKTN802的1.6kb的PstI/HincII片斷和來自pKTN808的1.0kb的HincII/BamHI片斷連接起來，形成2.6kb的含有VT2vp1基因的片斷，將該片斷再克隆到質(zhì)粒pUC119中，形成質(zhì)粒pKTN817。消化連接的條件參考《分子克隆試驗(yàn)指南》。
實(shí)施例2定點(diǎn)突變的形成多核苷酸的定點(diǎn)突變根據(jù)以前的描述進(jìn)行(參見Yamasaki，S.等1991.Important of arginine at position 170 of the A subunit of Vero toxin1 produced by enterohemorrhagic Escherichia coli for toxinactivity.Microb.Pathog.111-9)。將來自pKTN817的1.9kb的Sau3AI片斷克隆到M13mp18的BamHI位點(diǎn)形成M13mp18.CI。從E.coliCJ236(M13mp18.CI)中分離出單鏈的M13mp18.CI DNA，和突變的多核苷酸(見表1)退火，在體外進(jìn)行聚合和連接。將獲得的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化到E.coli BMH71-81 muts中，轉(zhuǎn)化獲得的噬菌體顆粒感染E.coli MV1184，分離其中的雙鏈DNA，檢測VT2vp1基因發(fā)生突變的M13mp18.CI衍生物。為了證實(shí)沒有其他的突變產(chǎn)生，將含有突變基因的整個基因利用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列測定，為了測序，用到下列五個合成多核苷酸作為引物與VT2vp1序列互補(bǔ)的15-20bp的序列(位置為255-269，514-530，767-781，1037-1056和1258-1237)。用亞磷酰胺法在Cyclone Plus DNASynthesizer(Milligen/Biosearch Division of Millipore，Tokyo)中合成上述多核苷酸，在一個滲透填充柱中用HPLC純化，該滲透填充柱用0.1M三乙胺醋酸，pH7.0和乙氰的梯度液通過。通過測定質(zhì)粒PKTN802和PKTN808的DNA序列，得出VT2vp1基因的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)從患浮腫的豬中分離出來的菌株E.coli KY010，O139H1的VT2vp1基因和Weinstein等報(bào)道的核苷酸序列是一致的，從而證實(shí)除了目的突變外沒有其他的突變產(chǎn)生。
表1 VT2vp1突變體及其相對非洲綠候腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性相對非洲綠突變體 導(dǎo)致突變用的多核苷酸 候腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性野生型 無 11(167Q-R170L) 5′(TGAACAGTAAGGCCTGTGCTG-3’ ＜1/10,000CCM2(167Q)5′-CTGAACCGTAAGGCTTGTGCTG-3’＜1/10,000CCM3(170L)5’-CTGAACAGTAAGGCTTCTGCTG-3’1/1,000CCM4(172L)5′-TGTATTTGCAGGAACCGTAAGG-3’1/100CCM5(W203L) 5’-CTGATTCTCCCCAGGTTCAG-3’1/10CM6(W203H)5′-GATTCTCCCGTGGTTCAGAGT-3’ 1/10實(shí)施例3VT2vp1和突變VT2vp1s的表達(dá)從M13mp18.CI中分離出6個含有突變的VT2vp1基因的EcoRI-HindIII片斷，分別克隆到pUC118的EcoRI-HindIII位點(diǎn)，形成pKTC1-pKTC6。再將PKTC1和pKTC2的EcoRV-HincII片斷克隆到pKTN817的EcoRV-HincII位點(diǎn)形成pKTC7和pKTC2d。含有pKTC7、pKTC2d、、pKTC3、pKTC4、pKTC5和pKTC6分別命名為E.coli CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6，這些E.coli菌株生產(chǎn)的突變毒素分別命名為CCM1、CCM2、CCM3、CCM4、CCM5和CCM6。含有突變質(zhì)粒的E.coliHB101(pKTN817)和E.coli菌株在含有100ug/ml氨比西林的LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞，在Handy Sonic UR-20p儀器(Tomy Seiko，Tokyo)中以最大功率超聲波處理60秒，13000×g離心混合物10分鐘，收集上清液。
實(shí)施例4VT2vp1和突變VT2vp1s的純化毒素粗樣的制備 將E.coliHB101(pKTN817)和E.coli CCM1-6分別在含有100ug/ml氨比西林的12升LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞，13000g離心20分鐘，大約得到180g細(xì)胞，將這些細(xì)胞懸浮在1/5體積的加有0.05M Tris-HCl緩沖液(pH8.6)的初始培養(yǎng)基中，間斷超聲波裂解。30000g離心30分鐘除去細(xì)胞粹片，在4℃下向上清夜中加入固體硫酸胺直至飽和，30000g離心30分鐘，收集沉淀。等體積溶解在0.05M Tris-HCl緩沖液(pH8.6)中，用同樣的緩沖液透析過夜，透析樣品在13000g下離心20分鐘，除去不容物，即得毒素粗樣。
DEAE-纖維柱層析 從14升培養(yǎng)基(180g細(xì)胞)中提取的毒素粗樣應(yīng)用于DEAE-纖維柱，該柱用0.05M Tris-HCl緩沖液(pH8.6)平衡。樣品用2000ml含有0.05M NaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液稀釋，然后用3000ml NaCl濃度梯度(0.05M-0.9M)Tris-HCl緩沖液(pH8.6)稀釋。收集能與抗VT2vp1毒素形成沉淀的那部分樣品，用Amicon PM-10膜超慮濃縮。
層析聚焦柱層析 DEAE-纖維柱的流出物在0.025M咪唑-HCL緩沖液(pH7.4)中透析后，應(yīng)用于含有30ml多聚緩沖交換劑PBE94(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)的1×40cm的柱，該柱已用0.025M咪唑-HCL緩沖液(pH7.4)平衡。材料用多聚緩沖液74(pH4.0)稀釋，以獲得pH7.0-4.0的梯度溶液，每4ml流出物的pH值增加0.04個單位。收集能與抗VT2vp1毒素形成沉淀的那部分樣品，用Amicon PM-10膜超慮濃縮。
高效液相色譜 層析聚焦柱的流出物在0.05M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中透析后，應(yīng)用于TSK-gel G-2000SW柱的高效液相色譜(HPLC)，在Gilson HPLC系統(tǒng)中，為302型(Gilson France SA，Villiers-le-bel，F(xiàn)rance)，該柱用含有0.2M NaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)平衡，材料用同樣的緩沖液以0.45ml/min的速率稀釋。收集能與抗VT2vp1毒素形成沉淀的那部分樣品，用AmiconPM-10膜超慮濃縮。
十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨平板凝膠電泳 將產(chǎn)物再進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨平板凝膠電泳。含0.1％SDS的十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰氨平板凝膠電泳如Laemmli的描述(參見Laemmli，U.K.1970.Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4.Nature 227680-685)，用的是16％的丙稀酰凝膠。樣品在0.1％SDS存在的情況下在100℃加熱4分鐘。
蛋白質(zhì)的濃度測定 用Bradford的方法以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)對照測量蛋白質(zhì)的濃度(參見Bradford，M.M.1976.A rapid and sensitivemethod for the quantitation of microgram quantities of protein utilizingthe principle ofprotein-dye binding.Anal.Biochem.72248-254)。
用bead-ELISA法測定VT2vp1和突變VT2vp1s的量 如以前所描述的，用bead-ELISA法測定野生型和突變型VT2vp1s的濃度，用純的VT2vp1免疫兔制備出一種抗VT2vp1的抗血清，用于檢測VT2vp1的VT2vp1特異性bead-ELISA法的靈敏度為200pg/ml(參見Cao等.1994.Specific detection of a Verotoxin 2 variant，VT2vp1，by abead-enzyme-linked immunosor-bent assay.Microbiol.Immunol.38435-440)。
實(shí)施例5突變VT2vp1毒素的活性檢測測定純化的VT2vp1突變體VT2vp1s的蛋白質(zhì)合成抑制活性、非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性和鼠致命性，與純化野生型VT2vp1比較。如表2所示，有兩個氨基酸替換的E167Q-R170L的毒性最弱，在抑制蛋白質(zhì)合成、非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性和鼠致命性活性方面分別是野生型毒素的1/1900、1/12500和1/2000。E167Q和R170L也表現(xiàn)出了生物活性的大大降低，雖然降低的程度小于E167Q-R170L降低的程度。
表2純化的突變體VT2vp1與純化的野生型VT2vp1不同生物活性比較毒素 蛋白合成抑制活性 非洲綠猴腎細(xì)胞毒性 鼠致死活性(ID50a)，μg) (CD50b)，ng) (LD50c)，μg)

非洲緑候腎細(xì)胞細(xì)胞毒性的檢測 非洲綠候腎細(xì)胞細(xì)胞毒性的檢測如以前的文章的描述(參見Noda等.1987.Purification and someproperties of Shiga-like toxin form Escherichia coli O157H7 that isimmunologically identical to Shiga toxin.Microb.Pathog.2339-349)。野生型的VT2Vp1和突變型的VT2vp1s用上文所描述的方法表達(dá)，測定毒素粗樣的突變VT2vp的非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性。如表1所示，CCM1的A亞基從N末端起第167位(E167)處的Glu和第170位(E170)的Arg分別被谷氨酸鹽和Leu所代替(E167Q-E170L)，CCM2第167位(E167)處被谷氨酸鹽替換(E167Q)，都表現(xiàn)出非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性的顯著降低。CCM3第170位被Leu代替(E170L)也表現(xiàn)出非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性的顯著降低。另外，其他三種突變VT2vp1s R172L(CCM4)、W202L(CCM5)和W202H(CCM6)都沒有表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性的活性降低。
鼠致命活性的檢測 毒素對于ddY鼠(Shimizu Laboratory SupplyCo，Kyoto)的致命活性的檢測如以前的文章所述。將0.5ml樣品腹內(nèi)膜注射到4-5周齡的鼠中。觀察動物7天，計(jì)算在2-7天內(nèi)的死亡數(shù)。用Reed和Muench描述的方法測定6只鼠群的LD50。
蛋白質(zhì)合成的抑制 毒素對于網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物的球蛋白合成的抑制作用的檢測如以前的文章所述(參見Ogasawara等.1988.Inhibition of protein synthesis by a Bero toxin(VT2 or Shiga-like toxin II)produced by Escherichia coli O157H7 at the level ofelongation facter 1-dependent aminoacyl-tRtNA binding toribosimes.Microb.Pathog.4127-135.)。如圖1所示，每個反應(yīng)用1μg純化的VT2vp1就能完全抑制兔網(wǎng)狀細(xì)胞的球蛋白合成，而每個反應(yīng)用10μg的E167Q-R170L對兔網(wǎng)狀細(xì)胞的球蛋白合成沒有明顯的抑制作用，每個反應(yīng)用10μg的其他兩種突變毒素對蛋白質(zhì)的合成有輕微的抑制作用。抑制50％的球蛋白合成的VT2vp1和突變VT2vp1s的量(ID50)被測定，結(jié)果如表2所示，表2還列出了導(dǎo)致50％的非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞死亡的突變VT2vp1的量(CD50)和殺死50％的用毒素接種的鼠所需的量(LD50)。
權(quán)利要求
1.一種DNA序列，它編碼弱毒化Vero毒素，并且具有下列序列之一(i)具有5’-CAGCACAGGCCTTACTGTTCAG-3’的核苷酸序列，(ii)在嚴(yán)格條件下與(i)限定的DNA序列雜交的DNA序列。
2.權(quán)利要求1的DNA序列，其具有5’-CAGCACAGGCCTTACTGTTCAG-3’的核苷酸序列。
3.含有權(quán)利要求1DNA序列的載體。
4.含有權(quán)利要求1DNA序列的重組病毒。
5.權(quán)利要求4的病毒，其中該病毒是腺病毒。
6.權(quán)利要求4的病毒，其中該病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒。
7.權(quán)利要求1或2的DNA編碼的弱毒化Vero毒素。
8.一種用于治療細(xì)胞增生性疾病的藥物組合物，該組合物含有權(quán)利要求3的載體和可藥用載體、輔助劑或賦形劑。
9.一種用于治療細(xì)胞增生性疾病的藥物組合物，該組合物含有權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)的病毒和可藥用載體、輔助劑或賦形劑。
10.權(quán)利要求7中的弱毒化Vero毒素在用于制備治療細(xì)胞增生性疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種弱毒化的毒素，更具體的說，本發(fā)明通過定點(diǎn)突變VT2vp1基因而獲得微弱毒性突變VT2vp1基因和微弱毒性的突變毒素，在該毒素中，VT2vp1的A亞基從N末端起第167位點(diǎn)處的glu和170位點(diǎn)處的arg分別被谷氨酸鹽和leu代替，該雙突變體E167Q－R170L比單突變體E167Q表現(xiàn)出更低的蛋白質(zhì)合成抑制活性、非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)毒性和鼠致命性，因此適合用于制備疫苗和治療細(xì)胞增生性疾病的藥物。
文檔編號A61K48/00GK1536083SQ03109430
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者劉笑燕, 吉田秀男, 任秀寶, 黃宗堂, 男 申請人:劉笑燕