專利名稱：細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針¹⁸F-Annexin B1及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬核醫(yī)學(xué)與分子影像技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是ー種細(xì)胞在基因引導(dǎo)下具有典型的形態(tài)學(xué)及生化特征的程序性死亡。細(xì)胞凋亡與人類眾多疾病密切相關(guān)，如腫瘤、心腦血管疾病、退行性病變、炎癥、免疫系統(tǒng)疾 病和移植排斥反應(yīng)等，以細(xì)胞凋亡通路為靶點(diǎn)的治療藥物有望為某些疾病帶來新的治療方法。例如，細(xì)胞凋亡異常在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，并且與腫瘤的許多生物學(xué)行為密切相關(guān)，影響腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后。人為誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可抑制腫瘤細(xì)胞增生，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。放射治療、許多化療藥物及其他抗癌藥物的作用即是通過使其敏感靶細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用的，而能否誘導(dǎo)凋亡成為篩選抗癌藥物的標(biāo)準(zhǔn)之一。目前醫(yī)療實(shí)踐中，采用的體外凋亡檢測方法包括形態(tài)學(xué)檢測、TUNEL法、DNA片斷化檢測、線粒體膜勢能檢測、半胱氨酸蛋白酶Caspase家族活性檢測和流式細(xì)胞術(shù)等；這些體外檢測方法都必須獲取一定量的組織標(biāo)本，不能進(jìn)行活體內(nèi)檢測，不能直觀評(píng)價(jià)凋亡在疾病病理生理過程的作用和治療方案的有效性，且存在取樣錯(cuò)誤、樣本處理和保存等人為的、不確定性因素，因此在臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值有很大的局限性。當(dāng)前，分子影像學(xué)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最活躍的前沿研究領(lǐng)域，是在分子、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平以三維圖像直接“看”活體內(nèi)與生物體生長發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)的生物化學(xué)的變化、表現(xiàn)、特征和定量。核醫(yī)學(xué)分子影像，包括正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(PET)、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描SPECT及其與CT的融合模式PET/CT、SPECT/CT，是分子影像學(xué)的起源地，在臨床上和基礎(chǔ)研究中已得到廣泛應(yīng)用，并成為其它分子影像模式的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，近幾年利用核醫(yī)學(xué)分子影像的活體顯像技術(shù)和方法，研究細(xì)胞凋亡在重大疾病比如腫瘤的診斷和治療中的應(yīng)用已經(jīng)成為熱點(diǎn)領(lǐng)域?；铙w細(xì)胞凋亡顯像的基礎(chǔ)是，細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)帶負(fù)電荷的磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞外側(cè)，在Ca2+存在的情況下膜聯(lián)蛋白能夠選擇性地與PS結(jié)合，并且二者具有很高的親合力，然后，利用放射性核素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的分子影像研究。有報(bào)道指出，膜聯(lián)蛋白是ー個(gè)龐大的蛋白質(zhì)家族，擁有160個(gè)蛋白質(zhì)成員，它們共同的特點(diǎn)是鈣離子依賴性結(jié)合帶負(fù)電荷的磷脂表面，氨基酸序列在結(jié)構(gòu)上都表現(xiàn)為同樣的布局即變化的N端尾和保守的C端核。Annexin V是最早被分離出來的膜聯(lián)蛋白家族中的ー員，最先被用于細(xì)胞凋亡檢測。Annexin BI是膜聯(lián)蛋白家族的ー個(gè)新成員，是最近由孫樹漢教授等首次克隆成功的。研究表明，Annexin BI同樣具有較強(qiáng)的鈣依賴性磷脂結(jié)合活性，對翻轉(zhuǎn)到凋亡細(xì)胞表面的PS具有很高的親和力，其體外檢測細(xì)胞凋亡的能力甚至還要優(yōu)于 Annexin V。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI的制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI，為由18F標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Annexin BI (可通過現(xiàn)有技術(shù)制備)，是由18F標(biāo)記的輔基與Annexin BI在一定條件下發(fā)生耦合生成、經(jīng)分離純化后制得。本發(fā)明的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI通過下述方法制備；在堿性條件下、溫度為25°C 40°C吋，18F標(biāo)記的輔基與膜聯(lián)蛋白Annexin BI 一起溫和混合反應(yīng)20 60min,再分離純化,制得探針18F-Annexin B I溶液；利用分析型凝膠HPLC檢測其放射化學(xué)純度，并跟蹤監(jiān)測三個(gè)半衰期^h)內(nèi)8F-Annexin BI在PBS溶液、小牛血清等體系中的體外穩(wěn)定性。 本發(fā)明中，所述的堿性條件是pH為8. O 9. O的堿性緩沖鹽溶液體系；本發(fā)明中，所述的18F標(biāo)記的輔基選自18F-SFB(N-succinimidyl 4-[18F]f luorobenzoate)、18F-FBA (4- [18F] f luorobenzoic acid) 18F-FPA (4_ [18F] f Iuoropropioacid) > 18F-NFP (p-nitrophenyl [18F] f luoropropionate)或 18F-SFMB (N-succinimidyl4- ([18F] fluoromethyl) benzoate)等；本發(fā)明中，所述的分離純化方法包括凝膠柱層析法、超濾離心膜分離法或凝膠HPLC法等在內(nèi)的多種分離方式凝膠柱層析法使用包括商品化預(yù)裝型凝膠柱(包含F(xiàn)1D-IO柱、micro-spin G-25柱、micro bio-spin P_6z柱等型號(hào))和自制型凝膠柱(填料包含Sephadex G-25、G-50、G-75、G-100等型號(hào)的凝膠)，使用的淋洗液包含PBS溶液(pH 7. 4)、磷酸鹽緩沖溶液(pH
7.4)和生理鹽水，收集對應(yīng)的洗出液既獲得純化的18F-AnnexinBl ；超離心膜分離法使用商品化超濾離心管(包含NanoSep、Milipore、Vivaspin等型號(hào))，其膜截留分子量范圍為3K-100K、即包含3K、10K、30K和50Κ在內(nèi)，使用的溶液包含PBS溶液(pH 7. 4)、磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)和生理鹽水，重復(fù)洗滌、過濾2_3遍之后，溶解膜上截留成分既獲得純化的18F-AnnexinBl ；凝膠HPLC法使用包括商品化半制備型和制備型凝膠柱和自制型凝膠柱(填料包含S印hadex G-25、G-50、G-75、G-100等型號(hào)的凝膠)，使用的流動(dòng)相包含PBS溶液(ρΗ7· 4)、磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)和生理鹽水，收集與18F-AnnexinBl對應(yīng)的放射性組份峰即獲得純化的18F-AnnexinB I。本發(fā)明的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI經(jīng)體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果顯示，所述的18F-Annexin BI體外穩(wěn)定性良好；誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的結(jié)合是對照組的兩倍以上；PET/CT生物分布顯像實(shí)驗(yàn)圖像表明，起始階段18F-Annexin主要分布在肝、腎，然后逐漸地肝腎清除，最后經(jīng)膀胱排出；18F-AnneXin BI注射后腫瘤圖像清晰，具有高的對比度；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI可用于其與凋亡細(xì)胞的體外結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)和PET/CT顯像在腫瘤、腎臟、肝臟、胸腺等相關(guān)組織器官的疾病診斷、治療療效評(píng)價(jià)、與治療新藥和新方法的篩選評(píng)價(jià)。本發(fā)明的18F-Annexin BI可用于體內(nèi)外細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的PET/CT顯像診斷與療效評(píng)價(jià)以及相關(guān)治療新藥和新技術(shù)物的篩選評(píng)價(jià)；具體而言，所述的18F-Annexin BI可用于腫瘤等疾病模型動(dòng)物體內(nèi)用于抗腫瘤等新藥的評(píng)價(jià)與快速篩選，也可用于放化療誘導(dǎo)腫瘤凋亡的評(píng)價(jià)，及進(jìn)行腫瘤放化療療效監(jiān)測與評(píng)估和相關(guān)治療新方法的臨床評(píng)價(jià)，還可用于腎臟、肝臟、胸腺、心臟等各種組織器官相關(guān)疾病的診斷、治療療效評(píng)價(jià)、與治療新藥和新方法的篩選評(píng)價(jià)。為了便于理解，下面通過附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。需要特別指出的是，具體實(shí)施例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，對本發(fā)明進(jìn)行各種修正或改變，這些修正和改變也將納入本發(fā)明范圍之內(nèi)。


圖I是本發(fā)明中制備18F-Annexin BI的Annexin BI和[18F] SFB標(biāo)記反應(yīng)混合物的凝膠HPLC圖譜。
圖2是本發(fā)明中純化的18F-Annexin BI的凝膠HPLC圖譜。圖3是本發(fā)明中兔腎凋亡18F-Annexin B1PET/CT圖，其中，左側(cè)箭頭為誘導(dǎo)凋亡的右腎，右側(cè)箭頭為正常対照的左腎。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :制備 18F-Annexin BI40°C下，[18F] SFB與Annexin BI在pH 8. 4的硼酸鹽緩沖溶液一起混合反應(yīng)20min,先用分析型凝膠HPLC (流動(dòng)相為PBS溶液(pH 7.4))檢測其標(biāo)記率，然后用凝膠柱層析法(ro-ΙΟ，淋洗液為PBS溶液(pH 7.4))進(jìn)行分離純化18F-Annexin BI，其標(biāo)記率為 15%和放射化學(xué)純度為 95%。實(shí)施例2 :制備 18F-Annexin BI室溫下，[18F] SFB與Annexin BI在pH 8. 6的硼酸鹽緩沖溶液一起混合反應(yīng)60min,先用分析型凝膠HPLC (流動(dòng)相為PBS溶液(pH 7. 4))檢測其標(biāo)記率，然后用超濾離心膜分離(NanoS印，溶液為PBS(pH 7. 4))進(jìn)行分離純化18F-Annexin BI，其標(biāo)記率為 10%和放射化學(xué)純度為 95%。實(shí)施例3 :制備 18F-Annexin BI35°C下，[18F] SFB與Annexin BI在pH 8. 5的硼酸鹽緩沖溶液一起混合反應(yīng)40min，先用分析型凝膠HPLC (流動(dòng)相為PBS溶液(pH 7.4))檢測其標(biāo)記率，然后用半制備型凝膠HPLC法(流動(dòng)相為PBS溶液(pH 7.4))進(jìn)行分離純化18F-Annexin BI，其標(biāo)記率為 20%和放射化學(xué)純度為 97%，對應(yīng)的HPLC圖譜分別見圖I和圖2。實(shí)施例4 =18F-Annexin BI的體外穩(wěn)定性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)37°C下，18F-Annexin BI分別在PBS溶液和小牛血清等體系中溫育三個(gè)半衰期(6h)，每個(gè)半衰期利用分析型凝膠HPLC跟蹤檢測其放射化學(xué)純度，評(píng)價(jià)其體外穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其在兩種體系中的體外穩(wěn)定性良好。實(shí)施例5 =18F-Annexin BI與凋亡細(xì)胞的體外結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期人急性T淋巴細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞，調(diào)整濃度為lX106/ml，向各實(shí)驗(yàn)組加入終濃度均為200ng/ml anti-Fas抗體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,對照組不加入anti_Fas抗體。實(shí)驗(yàn)組與對照組均在37°C、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)210min，以800Xg離心5min,用PBS溶液沖洗后加入100 μ L結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,然后將兩組細(xì)胞分為若干份，均加入等量的18F-Annexin BI溶液,室溫下混勻儀上孵育30min后，以800 Xg離心5min,分離結(jié)合部分與游離部分，用Y計(jì)數(shù)器分別測量沉淀(結(jié)合部分)和上清液(游離部分)的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算結(jié)合率與競爭結(jié)合率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，18F-Annexin BI與實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞的結(jié)合是對照組的兩倍以上。實(shí)施例6 :正常大鼠18F-Annexin BI PET/CT生物分布顯像實(shí)驗(yàn)經(jīng)尾靜脈將100 200 μ Ci 18F-Annexin BI溶液注射到正常大鼠體內(nèi)，分別于注射后10、30、60、120、180min行PET/CT顯像，觀察18F-Annexin BI在正常大鼠體內(nèi)BI的生物分布和代謝途徑。PET/CT圖像表明，起始階段(60min內(nèi))18F-Annexin主要分布在肝、腎。然后逐漸地肝腎清除，最后經(jīng)膀胱排出。18F-Annexin BI的這種分布代謝規(guī)律，為其在各臟器組織的最佳顯像時(shí)間提供參考依據(jù)。實(shí)施例7 :腫瘤凋亡模型大鼠18F-Annexin BI PET/CT顯像實(shí)驗(yàn)采取腹腔注射環(huán)磷酰胺的方式誘導(dǎo)荷W256腫瘤大鼠的腫瘤凋亡。將10 200 μ Ci18F-Annexin BI溶液經(jīng)尾靜脈將注射到荷瘤鼠體內(nèi)，然后分別于注射后30、60、120、180、240min行PET/CT顯像，觀察18F-Annexin BI在凋亡腫瘤組織和其它臟器組織的濃集與分布情況。PET/CT圖像表明，從注射后30min開始，18F-Annexin BI均在腫瘤組織有很高的濃集，隨著其從其它臟器中的快速清除，注射后120min18F-AnneXin BI在腫瘤與肌肉的吸收比達(dá)到8. O左右，具有高的對比度，圖像清晰，能夠用于腫瘤治療療效的評(píng)價(jià)與監(jiān)測。實(shí)施例8 :兔腎凋亡模型大鼠18F-Annexin BI PET/CT顯像實(shí)驗(yàn)采取缺血再灌注的方式誘導(dǎo)兔右腎凋亡。將50 300 μ Ci 18F-Annexin BI溶液經(jīng)耳緣靜脈將注射到兔體內(nèi)，然后分別于注射后30、60、90、120、240min行PET/CT顯像，觀察18F-Annexin BI在凋亡腎和其它臟器組織的濃集與分布情況。PET/CT圖像表明，注射后240min吋，18F-Annexin BI在凋亡右腎的濃集是對側(cè)左腎的2. 5倍(結(jié)果見圖3)。由于腎臟是18F-Annexin BI的主要代謝器官之一，因此，腎臟等排泄臟器的顯像時(shí)間宜在注射后4h以上，可以較好地用于腎臟相關(guān)疾病的診斷。實(shí)施例9 :心臟凋亡模型大鼠18F-Annexin BI PET/CT顯像實(shí)驗(yàn)采取靜脈注射放線菌酮的方式誘導(dǎo)大鼠肝臟凋亡。將50 500 μ Ci 18F-AnnexinBI溶液經(jīng)尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)，然后分別于注射后30、60、120、180min行PET/CT顯像，觀察18F-Annexin BI在凋亡肝臟和其它臟器組織的濃集與分布情況。PET/CT圖像表明，18F-Annexin BI在凋亡肝臟有大量的濃集，因其肝臟清除速率較快，注射120min后即可獲得高對比度、清晰的PET/CT圖像，可用于肝臟相關(guān)疾病的診斷。實(shí)施例10 :胸腺凋亡模型大鼠18F-Annexin BI PET/CT顯像實(shí)驗(yàn)采取腹腔注射地塞米松的方式誘導(dǎo)大鼠胸腺凋亡。將50 500 μ Ci 18F-AnnexinBI溶液經(jīng)尾靜脈注射到大鼠體內(nèi)，然后分別于注射后30、60、120、180min行PET/CT顯像，觀察18F-Annexin BI在凋亡胸腺組織和其它臟器組織的濃集與分布情況。PET/CT圖像表明，18F-Annexin BI在凋亡胸腺組織濃集明顯，因?yàn)槠湓谛叵僦車噜徑M織的清除速率較快，注射120min后即可獲得高對比度、清晰的PET/CT圖像，可用于胸腺相關(guān)疾病的評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI可用于其與凋亡細(xì)胞的體外結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)和PET/CT顯像在腫瘤、腎臟、肝臟、胸腺等相關(guān)組織器官的疾病診斷、治療療效評(píng)價(jià)、與治療新藥和新方法的篩選評(píng)價(jià)?！?br> 權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI，其特征在于，所述的18F-Annexin BI為由18F標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Annexin BI。
2.按權(quán)利要求I所述的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-AnnexinBI，其特征在于，所述的18F-Annexin BI是由18F標(biāo)記的輔基與Annexin BI在一定條件下發(fā)生稱合生成、經(jīng)分離純化后制得。
3.權(quán)利要求I的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-AnnexinBI的制備方法，其特征在于，包括下列步驟 在堿性條件下、溫度為25°C 40°C吋18F標(biāo)記的輔基18F-SFB或18F-FPA與膜聯(lián)蛋白Annexin BI 一起溫和混合反應(yīng)20 60min,然后分離純化,制得目標(biāo)探針18F-Annexin BI溶液。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的18F標(biāo)記的輔基選自18F-SFB. 18F-FBA18F-FPA'18F-NFP 或 18F-SFMB。
5.按權(quán)利要求3所述的備方法，其特征在于，所述的堿性條件是pH為8.O 9. O的堿性緩沖鹽溶液體系。
6.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的分離純化的方法選自凝膠柱層析法、超濾離心膜分離法或凝膠HPLC法。
7.權(quán)利要求I的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-AnnexinBI在體內(nèi)外細(xì)胞凋亡相關(guān)疾病的PET/CT顯像診斷與療效評(píng)價(jià)以及相關(guān)治療藥和治療方法的篩選評(píng)價(jià)中的用途。
8.按權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI在抗腫瘤藥的評(píng)價(jià)與快速篩選中的用途。
9.按權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI在放化療誘導(dǎo)腫瘤凋亡的評(píng)價(jià)，及腫瘤放化療療效監(jiān)測與評(píng)估和相關(guān)治療方法的評(píng)價(jià)中的用途。
10.按權(quán)利要求7所述的用途，其特征在干，所述的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin BI在腎臟、肝臟、胸腺或心臟相關(guān)疾病的診斷、療效評(píng)價(jià)或治療藥和方法的篩選評(píng)價(jià)中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬核醫(yī)學(xué)與分子影像技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin B1的制備與應(yīng)用；所述的細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin B1為由18F標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Annexin B1，是由18F標(biāo)記的輔基與Annexin B1在一定條件下發(fā)生耦合生成、經(jīng)分離純化后制得。本發(fā)明還提供細(xì)胞凋亡PET/CT活體分子影像探針18F-Annexin B1的制備方法。本發(fā)明可應(yīng)用在所述的18F-Annexin B1與凋亡細(xì)胞的體外結(jié)合能力實(shí)驗(yàn)和PET/CT顯像在腫瘤、腎臟、肝臟、胸腺等相關(guān)組織器官的疾病診斷、治療療效評(píng)價(jià)、與治療新藥和新方法的篩選評(píng)價(jià)中。
文檔編號(hào)A61K51/08GK102861346SQ20111019172
公開日2013年1月9日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者王明偉, 張勇平, 章英劍, 王芳, 孫樹漢 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院