專利名稱：通過永久性遺傳修飾其生物膜而由病原微生物產(chǎn)生非強(qiáng)毒微生物用于制備疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過永久性遺傳修飾其生物膜而由病原微生物產(chǎn)生非強(qiáng)毒微生物(non virulent microorganisms)的方法。特別地，本發(fā)明的方法提供了對膜的物理狀態(tài)和/或動(dòng)力學(xué)狀態(tài)的修飾，以獲得可用于疫苗制備的修飾的病原體。本發(fā)明還涉及這樣獲得的疫苗。
以下說明書中所用的術(shù)語MPS膜物理狀態(tài)克隆載體含有使其在轉(zhuǎn)染宿主后得以復(fù)制的完整遺傳信息的DNA分子。
去飽和酶基因編碼去飽和酶的基因，該酶在飽和脂肪酸(SFA)?；湹奶囟ㄎ恢?Δ6、Δ9、Δ12等)引入雙鍵以形成不飽和脂肪酸(UFA)。
差示掃描量熱法一種研究生物膜的熱改變行為(thermotropicbehavior)的技術(shù)。隨著生物膜的溫度從其脂質(zhì)成分(或者是其具有特定脂質(zhì)頭部基團(tuán)和脂肪酰鏈的區(qū)域)的凝膠溫度升高到液晶相變，烴鏈的活動(dòng)性增強(qiáng)并發(fā)生相應(yīng)的熱吸收的增加。凝膠到液體的脂質(zhì)相變一般是在低于或圍繞該生物體的生長溫度左右完成的。高溫?zé)徂D(zhuǎn)變通常歸因于蛋白變性，并且，與脂質(zhì)轉(zhuǎn)變形成對照，是不可逆轉(zhuǎn)的。
基因表達(dá)該術(shù)語是指生物體通過中間分子mRNA合成由特定基因所編碼的蛋白質(zhì)的全過程。
熱激基因(應(yīng)激基因)普遍存在的基因，當(dāng)細(xì)胞暴露于突然升高的溫度和/或各種不同形式的應(yīng)激時(shí)迅速轉(zhuǎn)錄激活。應(yīng)激的可誘導(dǎo)性由這些編碼序列啟動(dòng)子區(qū)域特定順式作用元件(如熱激元件，HSE)的存在而獲得。
熱激蛋白(HSP或應(yīng)激蛋白)暴露于應(yīng)激后細(xì)胞所迅速積聚的熱激基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，并且其功能包括指導(dǎo)新生多肽正確折疊、靶向變性蛋白(錯(cuò)誤折疊的)、保護(hù)線粒體和葉綠體的功能、mRNA成熟、其插入膜中以保護(hù)MPS，等等。
整合性(或內(nèi)在性)膜蛋白部分或完全地與磷脂雙層的疏水區(qū)相互作用，并且只能用去垢劑從膜中提取的任何膜蛋白。
巨噬細(xì)胞存在于血液、淋巴和其他組織中的細(xì)胞。其功能是吞噬和破壞病原體。有些巨噬細(xì)胞負(fù)責(zé)B和T淋巴細(xì)胞的激活。
膜包圍真核及原核細(xì)胞、細(xì)胞器(如線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核等)的半透性屏障，由脂雙層(磷脂、糖脂和固醇)組成，其中存在著內(nèi)在性膜蛋白或締合蛋白。作為本發(fā)明描述的遺傳操作的結(jié)果，所有的膜MPS均經(jīng)歷細(xì)胞特異性的變化。
膜流動(dòng)性描述膜內(nèi)分子的相對擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)的一種廣為應(yīng)用但主觀的術(shù)語。采用流動(dòng)性而不是粘性，是因?yàn)槟な瞧矫娴牟粚ΨQ結(jié)構(gòu)，并且其特性與體相(bulk phase)不具可比性。術(shù)語流動(dòng)性旨在傳達(dá)發(fā)現(xiàn)于脂質(zhì)呈液體-晶體層狀相的功能膜中的側(cè)向擴(kuò)散、分子搖擺和鏈伸縮的印象。
膜秩序(Membrane order)膜內(nèi)分子或分子域的運(yùn)動(dòng)動(dòng)作。膜秩序可通過估計(jì)順磁探針的運(yùn)動(dòng)和計(jì)算來自ESR或NMR光譜的秩序參數(shù)(order parameter)予以量化。
非層狀相脂質(zhì)在水介質(zhì)中的非雙層排列?？梢允橇切?HI)或倒六角形(HII)排列；膜中很少發(fā)現(xiàn)有HI相。
PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))利用互補(bǔ)于靶基因序列的特定寡核苷酸引物由專門的熱穩(wěn)定DNA聚合酶體外大量合成特定核苷酸序列的技術(shù)。
pG13含有處于瘰疬分枝桿菌(M.marinum)啟動(dòng)子(命名為PG13，acc.#AF092842)轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下的大腸桿菌(E.coli)綠色熒光蛋白(GFP)基因的質(zhì)粒。PG13是σ70-樣啟動(dòng)子，在瘰疬分枝桿菌(M.marinum)和結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)中均有發(fā)現(xiàn)，其在巨噬細(xì)胞中的誘導(dǎo)作用比分枝桿菌hsp60啟動(dòng)子要高40倍左右。
pNir體內(nèi)厭氧誘導(dǎo)的質(zhì)粒，含有大腸桿菌(Escherichia coli)pNirB啟動(dòng)子，受細(xì)菌蛋白FNR的調(diào)控，后者在厭氧條件下激活(Dunstan等，1999)。
啟動(dòng)子RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的特定DNA區(qū)域。該啟動(dòng)子區(qū)域含有RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)。
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑物理(如溫度、摩爾滲透壓濃度)化學(xué)(如激素)形式信號(hào)向其他形式信號(hào)的轉(zhuǎn)化。在細(xì)胞生物學(xué)中，該術(shù)語是指由于化學(xué)因子與膜或細(xì)胞受體的相互作用或者因?qū)δさ奈锢硇?yīng)而引起的系列過程，其在一個(gè)或多個(gè)特定的細(xì)胞應(yīng)答中達(dá)到頂點(diǎn)(如處于這種調(diào)控之下的序列的基因轉(zhuǎn)錄激活)。
轉(zhuǎn)化通過DNA重組技術(shù)獲得蛋白的方法，需要克隆編碼給定蛋白的基因，其中“克隆”是指分離、純化并測序編碼所述蛋白的基因。一經(jīng)克隆，該核苷酸序列可被插入合適的表達(dá)載體中，而所得的DNA重組分子可被引入到微生物中，在那里該基因與宿主DNA同時(shí)復(fù)制。該基因最終可用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)重新予以分離。
毒力基因這些基因被定義為編碼對宿主有毒的分子(毒素)或者編碼對于胞內(nèi)病原體在宿主環(huán)境內(nèi)生存所必需的蛋白產(chǎn)物的那些遺傳性狀。因此，編碼這些性狀的幾個(gè)基因很可能是響應(yīng)物理和/或環(huán)境的變化例如不同形式的應(yīng)激而加以調(diào)控。
背景技術(shù)：
熱激反應(yīng)，或者應(yīng)激反應(yīng)，是一種研究的較好的穩(wěn)態(tài)細(xì)胞應(yīng)答，主要是應(yīng)答變化多樣的外界應(yīng)激和/或病理狀態(tài)而參與細(xì)胞功能的維持。這一應(yīng)答通過迅速增加那些編碼應(yīng)激蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄而介導(dǎo)(Lindquist.1986)。已大量證明這種應(yīng)激基因mRNA合成的增加，以及相關(guān)的胞內(nèi)HSP的積聚，與耐熱性的獲得有關(guān)，伴隨著對后來暴露于其他形式的應(yīng)激或病理?xiàng)l件下的保護(hù)等(Singer和Lindquist 1998；van Eden和Young 1996)。業(yè)已證明溫度變化的初級(jí)傳感器，并且一般而言，其他形式應(yīng)激的初級(jí)傳感器，是定位于膜上的(Carratù等1996；Horvath等1998，Vigh和Maresca，1998；Suzuki等2000，Piper等2000；Torok等2001；Vigh和Maresca，1998)。進(jìn)一步的，最近的研究表明突然的溫度變化或者暴露于其他形式的應(yīng)激，決定了脂質(zhì)和蛋白膜組分的物理重建(Slater等1994)，繼之而來的是特定的基因應(yīng)答，旨在補(bǔ)償MPS的變化。從而，在MPS的變化與基因表達(dá)的調(diào)控之間存在著對話(cross-talk)，特別是對于熱激基因而言。我們將注意力集中在膜作為熱激的初級(jí)靶的重要角色方面，并嘗試了解膜內(nèi)適當(dāng)?shù)闹|(zhì)/蛋白互作是如何決定HS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的。這種分子互作已被證明精密地參與從外界到后續(xù)過程中的物理和化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化，最終，以特定的方式，轉(zhuǎn)錄激活應(yīng)激調(diào)控基因。反過來，某些HSP和膜特定區(qū)域(微區(qū)(domain))之間的互作重塑膜的物理狀態(tài)情況(整體相態(tài)、秩序、通透性等)。我們已證明，通過這些膜微區(qū)的不均勻分布，精確感知生物學(xué)和物理學(xué)環(huán)境調(diào)控信號(hào)以及不同形式應(yīng)激，可獲得基因表達(dá)特異性。這些研究有力地修正了我們對生物膜功能的觀點(diǎn)。我們提出膜的組成、結(jié)構(gòu)和物理狀態(tài)在急性熱激和病理狀態(tài)期間的細(xì)胞應(yīng)答中起著重要的和決定的作用(Vigh和Maresca，1998)。
在造成適當(dāng)MPS的試劑中，我們提及去飽和酶，通過其酶活，其調(diào)控膜的磷脂組成。去飽和酶是向SFA中引入雙鍵形成UFA的酶。SFA/UFA比是決定所有細(xì)胞的適當(dāng)MPS的關(guān)鍵因素之一(Cossins，1994)。最近證明可誘導(dǎo)性HSP的合成受許多因素突然和局部變化的調(diào)控，這些因素包括●膜脂組成●膜脂質(zhì)/蛋白互作●膜脂動(dòng)力學(xué)(MPS修飾)(Vigh等1998，Vigh和Maresca，未發(fā)表，1998)從而，應(yīng)激條件下MPS的變化重新確定HSP正常合成的閾值。
胞內(nèi)病原體，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasmacapsulatum)、錐蟲等，在發(fā)作時(shí)及感染巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞期間，通過轉(zhuǎn)錄激活應(yīng)激基因以及其他系列的種特異性基因，這里概括地定義為毒力基因，而誘導(dǎo)遺傳反應(yīng)?；虍a(chǎn)物直接的參與侵染/適應(yīng)機(jī)制，以一種協(xié)同的方式進(jìn)行，并負(fù)責(zé)病原體侵染、復(fù)制和在宿主中誘導(dǎo)疾病(毒力基因)的能力(Groisman和Ochman 1997)。這種大量、協(xié)同和普遍的遺傳反應(yīng)使得胞內(nèi)病原體例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)可以逃避宿主的免疫反應(yīng)而誘導(dǎo)疾病。
所有的細(xì)菌、真菌和寄生蟲，一般而言，尚未根除的造成致命疾病的因子，例如沙門氏菌病、傷寒癥、肺結(jié)核、組織胞漿菌病、念珠菌病、瘧疾、錐蟲病等，誘導(dǎo)HSP作為其在侵染之初對在宿主中所遭遇到的情況的反應(yīng)的一個(gè)基本部分(Groisman和Saier 1990)。真核病原體Hsp70和細(xì)菌Hsp60(GroEL)是主要抗原，構(gòu)成高達(dá)15％的細(xì)胞干重(Feige和van Eden，1996)。因而，應(yīng)激基因和那些參與毒性的基因是嚴(yán)格的相互連接的并且是遺傳上協(xié)同的(Groisman和Ochman1997)。然而這些毒力基因調(diào)控的細(xì)節(jié)還未闡明，已知這些序列的適當(dāng)表達(dá)也在侵染之初所合成的適量HSP的調(diào)控之下。對抗病原體的傳統(tǒng)方法被認(rèn)為幾乎是無效的，因?yàn)樗麄兪且源碳め槍σ粋€(gè)或少數(shù)幾個(gè)抗原的免疫反應(yīng)的疫苗的應(yīng)用為基礎(chǔ)的。舉例來說，有些結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株，肺結(jié)核的病因因子，日益增多地變得對現(xiàn)有抗生素具有抗性。由于鑒別新的有效無毒抗生素需要多年的實(shí)驗(yàn)工作和巨大的投資，急需制備新型的疫苗對抗新的抗性菌株。
關(guān)于沙門氏菌(Salmonella)，現(xiàn)有疫苗是●帶減毒株的疫苗，可腸胃外注射；●由純化的細(xì)菌莢膜制備的疫苗，可腸胃外注射；●由沙門氏菌(Salmonella)減毒株構(gòu)成的Ty21疫苗，口服給藥。
這樣的疫苗，盡管引起永久免疫性，但具有若干缺點(diǎn)。舉例來說，未確定由殺死的細(xì)菌所制備的疫苗真正不含活細(xì)胞，以及減毒疫苗不會(huì)回復(fù)成致病形式。也有可能由殺死的生物體所獲得的疫苗含有可能對于人類有毒的物質(zhì)、細(xì)胞或痕量培養(yǎng)基。進(jìn)一步的，帶殺死的生物體的疫苗常常具有高發(fā)的副作用，以及低水平的保護(hù)作用。通過迅速熱或化學(xué)處理獲得、由侵染性減毒顆粒制備的疫苗，可能含有生理蛋白折疊被改變(變性)的抗原，從而改變天然的免疫應(yīng)答。
不涉及應(yīng)用減毒株的疫苗通常由單個(gè)或幾個(gè)抗原組成，其與天然的免疫應(yīng)答相比，僅僅產(chǎn)生部分或不完全的保護(hù)。
一般而言，這具有導(dǎo)致當(dāng)今疫苗低功效的缺點(diǎn)，因?yàn)樵谌祟愔?，像一般而言的哺乳?dòng)物中，更一般而言的高等真核生物中一樣，抵抗侵染因子的天然保護(hù)機(jī)制包含針對整個(gè)微生物體和其結(jié)合的所有抗原的復(fù)雜免疫應(yīng)答。
現(xiàn)在作者猜測，并且經(jīng)試驗(yàn)證明，改變生理學(xué)MPS和病原體的應(yīng)激反應(yīng)，有可能減毒菌株用于疫苗制備，避免上述的副作用。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種方法永久性地遺傳修飾微生物的MPS，所述微生物特別是胞內(nèi)病原體(如細(xì)菌、真菌、寄生蟲)例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)、莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)、錐蟲類等，目的是改變侵染發(fā)作時(shí)這種病原體內(nèi)HSP的合成和積聚，以及改變那些種特異性的基因產(chǎn)物的合成和積聚，其調(diào)控作為MPS的結(jié)果而被改變，包括由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途在介導(dǎo)其激活的基因(如c-fos，fos B，junB，junD，MAP激酶，基因)，其中宿主可以是靶細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞、一般而言高等生物或者哺乳動(dòng)物或人類的細(xì)胞。所以，作為這種修飾的結(jié)果，病原體變成非強(qiáng)毒的(減毒的)。
另一個(gè)目的是利用這些減毒株制備疫苗。
進(jìn)一步的目的是開發(fā)一類新的疫苗用于人類以及一般而言用于動(dòng)物，其包含該修飾的病原體。
進(jìn)一步的目的是制備病原微生物減毒的非強(qiáng)毒株(non-virulentstains)的方法，所述微生物例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)、莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)等，這通過轉(zhuǎn)化攜帶和表達(dá)編碼集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis) PCC6803Δ12-去飽和酶或沙門氏菌(Salmonella)或其他原核和真核微生物(如釀酒酵母(S.cerevisiae)或莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)的Δ9-去飽和酶)的其它去飽和酶的基因或編碼導(dǎo)致MPS干擾(perturbation of MPS)(脂相變、通透性)的整合膜蛋白的基因的載體來實(shí)現(xiàn)。利用根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的遺傳修飾，有可能獲得，例如在沙門氏菌(Salmonella)中，總膜(外膜和內(nèi)膜或胞質(zhì)膜的混合物)的蛋白/脂質(zhì)比從100左右(強(qiáng)毒株)升高到170左右(遺傳修飾株)(圖4)，或者，例如在瘰疬分枝桿菌(M.marinum)突變株中，其細(xì)胞外膜的主要脂相變至少下降4℃。該方法可擴(kuò)展到本文下面作為非限制性實(shí)例所列的其他胞內(nèi)病原體。
進(jìn)一步的目的在下面的發(fā)明詳細(xì)描述中是明顯的。
附圖簡述

圖1含集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803(登錄號(hào)X53508，CyanoBase http//www.Kazusa.or.jp/cyano/)Δ12-去飽和酶基因(SEQIDN.1)(圖B)的載體(圖A)，克隆在處于PNir啟動(dòng)子調(diào)控下的pNir質(zhì)粒的NdeI限制性位點(diǎn)。NdeI限制性位點(diǎn)利用合適引物(desA-NdeI3’-SEQ ID N.3和desA-NdeI 5’-SEQ ID N.4)(圖C)通過PCR產(chǎn)生。FNR是FNR蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)，F(xiàn)NR蛋白是厭氧條件下細(xì)菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的，并激活起始于PNir啟動(dòng)子的下游轉(zhuǎn)錄。
圖2 在37℃培養(yǎng)并在自37℃到41、45及47℃熱激后15分鐘，鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)中如Northern印跡所示的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去飽和酶基因的表達(dá)。在僅由空載體(pNir)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，檢測不到內(nèi)源性Δ12-去飽和酶的mRNA。
圖3從厭氧條件下表達(dá)Δ12-去飽和酶基因或者含有空載體的沙門氏菌(Salmonella)裂解制備物的沉淀物級(jí)分中純化的蛋白提取物(7和15μg蛋白)的變性膠(a＝在O2中生長至對數(shù)晚期的鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)(pNir)，b＝在O2中生長至對數(shù)晚期的鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)(pΔ12)，c＝在無O2條件下生長20小時(shí)的鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)(pNir)，d＝在無O2條件下生長20小時(shí)的鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)(pΔ12))。箭頭表示Δ12-去飽和酶蛋白。在細(xì)菌裂解物的可溶性級(jí)分中鑒別不到Δ12-去飽和酶蛋白。細(xì)胞在氧氣中生長至對數(shù)晚期以耗竭氧氣(厭氧生活)或在厭氧條件下生長。
圖4含pNir∷Δ12構(gòu)建物-des或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)中總膜的蛋白/脂質(zhì)比的變化。
圖5考馬斯凝膠沙門氏菌(Salmonella)外膜蛋白的SDS PAGE(17％)電泳。細(xì)胞生長于30℃。Western印跡含pNir∷Δ12構(gòu)建物或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)外膜分級(jí)物中Δ12-去飽和酶的鑒定。
圖6集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)Δ12-去飽和酶抗體按1∶2000稀釋使用。集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)總細(xì)胞提取物作為陽性對照應(yīng)用(Syn.)。
圖7含pNir∷Δ12構(gòu)建物-des或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)膜通透性的變化。在25°-40℃之間，膜蛋白Δ12去飽和酶的過量產(chǎn)生誘導(dǎo)Δ12-轉(zhuǎn)化的沙門氏菌(Salmonella)菌株(細(xì)胞生長于30℃)的外膜通透性升高。
圖8含pNir∷Δ12構(gòu)建物-des或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)膜通透性的變化。數(shù)據(jù)組與圖7相同，并表示為兩套數(shù)的比值。
圖9由差示掃描量熱法所檢測的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)Δ12-去飽和酶的過量產(chǎn)生對外膜向熱致變行為的DSC影響。第一次和第二次熱掃描的原始數(shù)據(jù)。第一次熱掃描的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。膜分離自在30℃生長的細(xì)胞。
圖10放大和顯示了圖9的DSC主信號(hào)峰。
圖11含pNirΔ12構(gòu)建物-des或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)中DnaK(hsp70)基因的表達(dá)，Northern印跡。細(xì)胞在30℃生長并于37°、39°及43℃熱激15分鐘。
圖12Northern印跡顯示的含pNirΔ12構(gòu)建物-des或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)中DnaK(hsp70)基因的表達(dá)。細(xì)胞在37℃生長并于41°、43°、45°及47℃熱激15分鐘。
圖13含有帶des的pNirΔ12構(gòu)建物或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)中GroEL基因(hsp60)的表達(dá)，Northern印跡。細(xì)胞在30℃生長并于37°、39°及43℃熱激15分鐘。
圖14含有帶des的pNirΔ12構(gòu)建物或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)中GroEL基因(hsp60)的表達(dá)，Northern印跡。細(xì)胞在37℃生長并于41°、43°、45°及47℃熱激15分鐘。
圖15含有帶des的pNirΔ12構(gòu)建物或僅含pNir的沙門氏菌(Salmonella)DnaK誘導(dǎo)的定量。數(shù)據(jù)是圖11和12的那些。
圖16Northern印跡顯示含(Δ12)pNir∷Δ12構(gòu)建物或Nir(pNir；對照)的沙門氏菌(Salmonella)中的DnaK(hsp70)和IbpB(hsp17)基因的表達(dá)，Northern印跡。細(xì)胞在30℃生長并于45℃熱激15分鐘。
圖17(a-c)苯甲醇毒性曲線。暴露于增加濃度的(5至80mM)苯甲醇(BA)30分鐘對鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)生長的影響。
圖18含pNir∷Δ12構(gòu)建物-des或僅含pNir或用50mM BA處理的沙門氏菌(Salmonella)中DnaK的誘導(dǎo)表達(dá)(Northern印跡)。
圖19(a-f)用pNirΔ12構(gòu)建物-des或僅用pNir(強(qiáng)毒株)轉(zhuǎn)化鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)對巨噬細(xì)胞感染的影響。巨噬細(xì)胞以1∶1的巨噬細(xì)胞/沙門氏菌(Salmonella)比(MΦ/S.th.1∶1)感染不超過30分鐘。在巨噬細(xì)胞裂解后，回收沙門氏菌(Salmonella)，并取小份涂布于瓊脂上測定存活。經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞不再具有強(qiáng)毒性。
圖20(a-e)用50mM BA處理鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)及其對巨噬細(xì)胞感染的影響。巨噬細(xì)胞用沙門氏菌(Salmonella)(MΦ/S.th.1∶1)感染不超過60分鐘。在巨噬細(xì)胞裂解后，回收沙門氏菌(Salmonella)，并取小份涂布于瓊脂上測定存活。在最初的休克之后，細(xì)胞通過細(xì)胞重構(gòu)建得以恢復(fù)。
圖21載體pG13Δ12，含集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去飽和酶基因(DesA)，受PG13啟動(dòng)子調(diào)控。該基因克隆在該載體的NdeI限制性位點(diǎn)。
圖22用含有集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)Δ12-去飽和酶基因的pG13Δ12轉(zhuǎn)化的瘰疬分枝桿菌(M.marinum)中Δ12-去飽和酶基因的表達(dá)。對照細(xì)胞中沒有可檢測的表達(dá)。
圖23用pG13和含有處于PG13啟動(dòng)子調(diào)控之下的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去飽和酶基因的pG13Δ12轉(zhuǎn)化的瘰疬分枝桿菌(M.marinum)的生長。
圖24瘰疬分枝桿菌(M.marinum)以及用含有處于PG13啟動(dòng)子調(diào)控之下的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC680312-去飽和酶基因的pG13Δ12轉(zhuǎn)化的細(xì)菌的總膜蛋白/脂質(zhì)的變化。
圖25用含有處于PG13啟動(dòng)子調(diào)控之下的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去飽和酶基因的pG13Δ12轉(zhuǎn)化的瘰疬分枝桿菌(M.marinum)的存活被終止，而對照細(xì)胞的生長按照預(yù)期得以恢復(fù)。
圖26經(jīng)遺傳修飾的莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)強(qiáng)毒株(D3)中hsp70基因轉(zhuǎn)錄的變化(Northern印跡)。
圖27莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)G217B強(qiáng)毒株和經(jīng)修飾的D3株在鼠源巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生長能力的比較。D3株在巨噬細(xì)胞內(nèi)不繁殖。
圖28用G217B強(qiáng)毒株接種以及用非強(qiáng)毒性D3接種后又用正常G217B強(qiáng)毒株攻擊的小鼠的存活曲線。
發(fā)明的詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的方法可利用遺傳工程技術(shù)，例如象Sambrook等(1989)描述的技術(shù)，通過構(gòu)建含有能夠在感染期間驅(qū)動(dòng)目的基因在將最終用于獲得特定疫苗的病原體中表達(dá)(如在厭氧條件下，或在細(xì)胞中例如巨噬細(xì)胞或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞、在人或動(dòng)物宿主中)的啟動(dòng)子的載體來進(jìn)行。然后該修飾菌株可用來制備注射疫苗、或可用于口服或經(jīng)由鼻腔噴霧的疫苗。
本發(fā)明的方法可根據(jù)如下的主要步驟來概括-對每一種特定的病原微生物構(gòu)建合適的載體以調(diào)節(jié)受控于合適啟動(dòng)子的基因的(組成型或誘導(dǎo)型)表達(dá)，以及蛋白產(chǎn)物的相對生產(chǎn)，所說的蛋白能夠修飾病原體的膜，例如改變膜脂的脂酰鏈內(nèi)的飽和度水平的酶或者能夠移位并與細(xì)胞膜上預(yù)存的脂蛋白復(fù)合體相互作用的膜整合蛋白；該載體可包含，舉例來說，Δ9-去飽和酶或Δ12-去飽和酶基因或其他去飽和酶基因或者編碼整合膜蛋白或其衍生物的基因；-用所述的每種病原微生物的特定載體遺傳轉(zhuǎn)化強(qiáng)毒株(病原體)；-表達(dá)能夠直接(整合蛋白)或間接(去飽和酶)與病原體的膜相互作用的蛋白產(chǎn)物；可對強(qiáng)毒病原體進(jìn)行體外測試以驗(yàn)證對應(yīng)激基因、去飽和酶、整合膜蛋白、和/或毒力基因和/或信號(hào)途徑之轉(zhuǎn)錄的影響(如通過Northern印跡)。
這樣得到的非強(qiáng)毒株可根據(jù)已知的方法予以加工，以便利用它作為有效成分以有效量制備疫苗。
熟練技術(shù)人員可利用根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的病原菌株進(jìn)行疫苗的制備?？梢越⒐に噥碇苽浒x形劑、佐劑和其他可用于例如皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜、陰道、口服、直腸、鼻用給藥的常規(guī)試劑的疫苗。
這種遺傳學(xué)方法特別適用于所有的胞內(nèi)病原體，原核生物和真核生物，但不排除胞外病原體?？蓱?yīng)用本發(fā)明的方法的病原體的例子是未窮舉的本列表中提及的那些*嚴(yán)格胞內(nèi)細(xì)菌衣原體屬(Chlamydia)物種(肺炎衣原體和沙眼衣原體)、伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)、恰非埃里希氏體(Ehrlichia chaffeensis)、立克次氏體屬(Rickettsiae)。
*兼性胞內(nèi)細(xì)菌侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)(結(jié)核分枝桿菌(M.tubereulosis)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)、諾卡氏菌屬(Nocardia)物種(足分枝菌病)、巴爾通氏體屬(Bartonella)物種、布魯氏菌屬(Brucella)物種、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisella tularensis)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌屬(Listeria monocytogenes)物種、沙門氏菌屬(Salmonella)物種、志賀氏菌屬(Shigella)物種。
*其他細(xì)菌布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(萊姆病)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、奈瑟氏球菌屬(Neisseriae)物種、葡萄球菌屬(Staphylococci)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、耶爾森氏菌屬(Yersiniae)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)。
*真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、假絲酵母菌屬(Candida)物種、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarinii)。
*寄生蟲溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、利什曼原蟲屬(Leishmania)物種、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和間日瘧原蟲(vivax)及其他種、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、克魯斯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)。
在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，不同類別的病原體組合和/或混合物是可能的。
根據(jù)本發(fā)明的方法可得到修飾的MPS，并且當(dāng)他們結(jié)合宿主時(shí)，病原體中合成的HSP的量下降，宿主可以是巨噬細(xì)胞，或者，一般而言，高等真核生物、尤其是哺乳動(dòng)物、更具體是人類的任何類型的細(xì)胞。HSP量的下降是由MPS的干擾控制的，MPS的干擾是用本發(fā)明中描述的方法誘導(dǎo)的，并且作為實(shí)例，可包含以下方面的變化●膜脂組成●膜內(nèi)蛋白與脂質(zhì)的比●膜通透性以及熱相變所以，根據(jù)本發(fā)明的MPS的遺傳修飾，在病原體所遭遇的應(yīng)激條件下(當(dāng)病原體與其侵染的宿主細(xì)胞相互作用并被內(nèi)在化時(shí))，確立了一種新的(不同的)應(yīng)激(熱激或hs)基因正常轉(zhuǎn)錄的應(yīng)激閾。從而，MPS的修飾將病原體“凍結(jié)”在生理和免疫活性狀態(tài)，帶有全套未加修飾的抗原。在侵染期間，修飾的病原體不能在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間合成適量的參與病原體對存在于宿主中的條件的適應(yīng)過程和允許其侵染、增殖以及最終導(dǎo)致疾病的特定蛋白。修飾病原體適應(yīng)宿主條件的能力下降，所以，不發(fā)生疾病。
用這種方法，減毒病原體的抗原并不在結(jié)構(gòu)上被修飾，因而，病原體是具完全免疫活性的。此外，這些修飾的胞內(nèi)病原體不能正確地誘導(dǎo)避免宿主免疫反應(yīng)所必需的遺傳的和確定的種特異性程序(例如新的特定抗原和蛋白)。所以，本發(fā)明的方法可以產(chǎn)生毒力機(jī)理減弱但具完全免疫活性的病原體株系。這樣獲得的減毒活疫苗代表了對抗胞內(nèi)病原體的最好保護(hù)。
根據(jù)本發(fā)明一個(gè)特別的實(shí)施方式，我們在實(shí)例中描述了制備鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)和莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)非強(qiáng)毒菌株的主要步驟以及他們用于疫苗制備的用途。
鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)和莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)等減毒非強(qiáng)毒菌株的制備可通過用載體轉(zhuǎn)化相應(yīng)的病原微生物獲得，該載體攜帶和表達(dá)集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去飽和酶基因或者沙門氏菌(Salmonella)或其他原核和真核生物體(例如莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)或釀酒酵母(S.cerevisiae) Δ9-去飽和酶等)的去飽和酶基因，或者編碼能夠?qū)е虏≡wMPS干擾的整合膜蛋白的其他基因。特別地，插入細(xì)胞膜(外膜及內(nèi)膜或者胞質(zhì)、核、線粒體等膜)的整合膜蛋白改變預(yù)存的蛋白/脂質(zhì)比從而改變其與膜在給定的溫度范圍內(nèi)恰當(dāng)?shù)匦惺构δ苊芮邢嚓P(guān)的通透性以及熱相變性質(zhì)(thermalphase transition profile)。這樣的修飾導(dǎo)致廣泛的或局部的MPS的修飾，這是編碼整合膜蛋白的外源基因表達(dá)的結(jié)果，其效果與去飽和酶通過變更SFA/UFA比而改變這些參數(shù)的酶活性所決定的效果相似。
該方法包含以下步驟●為給定的致病因子構(gòu)建合適的載體，其包括這樣的基因，該基因的產(chǎn)物直接或間接的修飾病原體的MPS；●用藍(lán)藻類細(xì)菌(cyanobacterium)集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去飽和酶基因遺傳轉(zhuǎn)化病原菌鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)的強(qiáng)毒株，并用含有受控于可驅(qū)動(dòng)下游基因在病原體侵染階段期間表達(dá)的啟動(dòng)子，例如Downs菌株的上調(diào)啟動(dòng)子的Δ9-去飽和酶基因的質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化強(qiáng)毒莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)G217B菌株(G217BATCC 26036，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockwille，MD)；●Δ12-或Δ9-去飽和酶基因或其他去飽和酶基因或編碼整合膜蛋白的基因的超表達(dá)；●去飽和酶的酶活性；●蛋白產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到膜內(nèi)；●介由酶活性和/或蛋白在膜中插人而改變MPS。
用所述方法得到的修飾誘導(dǎo)應(yīng)激基因的表達(dá)型式改變，以及其他基因例如負(fù)責(zé)毒力的那些和/或參與適應(yīng)宿主中存在的條件和牽涉細(xì)胞存活及病原體毒性的基因和/或在MPS調(diào)控下受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)模式的改變。MPS的干擾以及基因表達(dá)的改變與巨噬細(xì)胞感染期間和動(dòng)物感染模型中鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)的毒力喪失相關(guān)。如此得到的減毒株誘導(dǎo)針對鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)強(qiáng)毒株的免疫保護(hù)。
用本發(fā)明的方法所得到的結(jié)果證明，通過過量表達(dá)去飽和酶基因或者局部或廣泛修飾MPS的膜蛋白用遺傳方法獲得的膜干擾，或者用干擾MPS的分子處理膜，導(dǎo)致沙門氏菌(Salmonella)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)(以及其他原核和真核胞內(nèi)病原體)積累適量應(yīng)激蛋白的能力顯著改變。
當(dāng)利用遺傳轉(zhuǎn)化的菌株感染巨噬細(xì)胞細(xì)胞系(J774)或鼠源巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞或感染對感染易感的動(dòng)物或人類時(shí)，如此獲得的膜干擾導(dǎo)致沙門氏菌(Salmonella)、瘰疬分枝桿菌(M.marimum)和莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)(以及其他病原體)的毒力永久性喪失。
實(shí)例中描述的遺傳操作程序可以產(chǎn)生非強(qiáng)毒菌株，例如鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)和莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)，從而允許開發(fā)針對這些病原體的疫苗。這一技術(shù)可應(yīng)用于其他或者是原核生物或者是真核生物的胞內(nèi)病原體(參見上述列表)以獲得其他減毒株來開發(fā)其他疫苗。
提供下列實(shí)施例和附圖是用來更好地顯示本發(fā)明的，而不應(yīng)當(dāng)理解為是對其范圍的限制。
實(shí)施例1通過PCR克隆了完整的藍(lán)藻類細(xì)菌(cyanobacterium)集胞藍(lán)細(xì)菌屬(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去飽和酶基因(SEQ IDN.1)，并插入到pNir載體中(圖1)，處于在厭氧條件下可誘導(dǎo)的大腸桿菌(E.coli)PNirTM啟動(dòng)子(Dunstan等1999)的調(diào)控，并利用它來轉(zhuǎn)化野生型強(qiáng)毒鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)菌株。在正常生長時(shí)或在感染巨噬細(xì)胞期間及在對感染易感的動(dòng)物中，都可以用能夠驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)的其他啟動(dòng)子替代PNir。
轉(zhuǎn)化株是用pNir永久性遺傳修飾的生物體，并且在厭氧條件下過量表達(dá)提高水平的Δ12-去飽和酶mRNA(圖2)，后者被高水平地翻譯為編碼蛋白(圖3)。Δ12-去飽和酶基因至少在不超過47℃時(shí)編碼高水平的蛋白(SEQ ID N.2)(圖2)。按照文獻(xiàn)描述(Janoff等，1979)從沙門氏菌(Salmonella)中分離內(nèi)、外及總膜。利用十七烷酸(heptadecaonic acid)作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)通過GC分析測定分離的沙門氏菌(Salmonella)總膜中的脂含量。用改良的膜蛋白Lowry分析法(Peterson，1983)測量蛋白濃度。圖4顯示了對照和轉(zhuǎn)化的沙門氏菌(Salmonella)細(xì)胞的總膜蛋白/脂質(zhì)比的測定。Δ12-去飽和酶基因的外源性表達(dá)及其蛋白產(chǎn)物在總膜中的定位導(dǎo)致膜P/L的強(qiáng)烈增加，增加至少60％，這決定了膜的不穩(wěn)定性，并決定了誘導(dǎo)熱激基因、或許其他基因轉(zhuǎn)錄的信號(hào)的改變。
分離的沙門氏菌(Salmonella)外膜的蛋白分析。外膜蛋白的SDSPAGE分析揭示pNirΔ12菌株與pNir相比蛋白含量顯著增加(考馬斯凝膠，圖5)。利用集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)的Δ12-抗體的Western印跡分析證實(shí)了pNirΔ12外膜分級(jí)分離物中去飽和酶的存在，其在pNir菌株中檢測不到(Western印跡，圖6)。作為陽性對照，應(yīng)用了總細(xì)胞提取物(Syn.)。作為Δ12去飽和酶過表達(dá)的結(jié)果，檢測到水平大量增加的額外的蛋白帶(考馬斯凝膠)。該蛋白帶進(jìn)一步用質(zhì)譜測量法予以表征，發(fā)現(xiàn)由沙門氏菌(Salmonella)的兩種熱激蛋白，IbpA和IbpB構(gòu)成(小HSP家族的成員)。
質(zhì)譜測量法對pNirΔ12菌株外膜上sHSP的鑒定。為進(jìn)一步表征凝膠中鑒定到的蛋白，切下考馬斯藍(lán)染色的來自沙門氏菌(Salmonella)(pNirΔ12)外膜制備物的1D凝膠帶(MW＜20kDa)。使該凝膠帶經(jīng)過膠內(nèi)消化程序(在Cys巰基被還原(用DTT)和烷化(用碘乙酰胺)之后，用0.1μg胰蛋白酶在37℃作用7小時(shí))。從凝膠中抽提胰蛋白酶消化肽產(chǎn)物后，用C18 ZipTip進(jìn)行純化，并且所得的未分離的混合物在二羥基苯甲酸基質(zhì)中用MALDI-TOF分析。以MALDI分析為基礎(chǔ)，在MS-Fit數(shù)據(jù)庫中查找，從混合物中鑒定到兩種蛋白熱激蛋白IbpB(腸沙門氏菌(Salmonella enterica)，NCBI#(03.26.2002)16762514，MW16kDa)。該命中識(shí)別了30％的測得的m/z值，覆蓋該鑒定蛋白的40％。該鑒定結(jié)果進(jìn)一步通過MH+＝961.65的PSD光譜證實(shí)，通過MS-Tag數(shù)據(jù)庫查找鑒定為ITLALAGFR，上述蛋白的[47-55](圖5)。
熱激蛋白IbpA(腸沙門氏菌(Salmonella enterica)NCBI#(03.26.2002)16762513，MW16kDa)。該命中識(shí)別了另外35％測得的m/z值，覆蓋該鑒定蛋白的40％。該鑒定結(jié)果進(jìn)一步通過MH+＝1124.58的PSD光譜證實(shí)，通過MS-Tag數(shù)據(jù)庫查找鑒定為NFDLSPLYR，上述蛋白的[3-11](圖5)。
體內(nèi)檢測的作為膜通透性函數(shù)的膜功能性的干擾。圖7顯示了苯基萘基胺(NPN)熒光的變化。NPN是不帶電荷的親脂性染料，在水環(huán)境中微弱發(fā)熒光，但是其在非極性疏水環(huán)境例如在細(xì)胞膜中極大提高。作為外膜通透性破壞的結(jié)果，NPN標(biāo)記越來越多的膜，增加其熒光(Tsuchido等1989)。在廣泛的溫度范圍內(nèi)(在25°和55℃之間)，Δ12-去飽和酶蛋白的過表達(dá)誘導(dǎo)膜去穩(wěn)定，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞與僅含有質(zhì)粒的細(xì)胞相比，其外膜永久滲漏。在25°-40℃之間增加的滲漏的效果非常顯著，但其在較高的熱激溫度時(shí)不存在。顯然，高于42-45℃，熱誘導(dǎo)的膜坍縮(collapse)超過在較低溫度下檢測到的蛋白/磷脂失衡所造成的膜解體(desintegration)而占據(jù)主導(dǎo)地位。圖8顯示的是，利用與圖7相同的數(shù)據(jù)，通過在25°-40℃誘導(dǎo)Δ12-去飽和酶轉(zhuǎn)化的沙門氏菌(Salmonella)菌株的提高的外膜通透性(細(xì)胞生長于30℃)，過量產(chǎn)生膜結(jié)合Δ12-去飽和酶的效果。
差示掃描量熱法。通過差示掃描量熱法(DSC)來檢測過量表達(dá)集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)Δ12-去飽和酶對沙門氏菌(Salmonella)外膜熱致變行為的影響。在10°和65℃之間的溫度范圍內(nèi)，在第一次上行掃描(up-scan)中觀察到一個(gè)主吸熱峰，其在第二次上行掃描中同樣重復(fù)出現(xiàn)，然而在高溫度范圍內(nèi)(65°-110℃)出現(xiàn)數(shù)個(gè)主吸熱峰。高溫度范圍內(nèi)的吸熱峰在第二次上行掃描中消失，該結(jié)果提示這些峰是來自于不可逆的蛋白變性。在15°-45℃溫度區(qū)域的可逆吸熱峰對應(yīng)于膜脂質(zhì)的相轉(zhuǎn)變(圖9)。分離自pNir和pNir∷Δ12菌株的外膜的轉(zhuǎn)變中點(diǎn)分別為34.1℃和30.8℃(圖10)。這些結(jié)果指示Δ12-去飽和酶的過量表達(dá)顯著降低細(xì)胞外膜中某些脂質(zhì)區(qū)域的轉(zhuǎn)變溫度。
由于Δ12-去飽和酶蛋白的過量表達(dá)所致的MPS干擾重建了熱激基因(應(yīng)激基因DnaK(圖11、12)和GroEL(圖13、14))表達(dá)的最佳溫度，在30℃和47℃間及在宿主細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和哺乳動(dòng)物)中存在的不利條件下，其積累HSP的模式發(fā)生顯著變化。圖15顯示了生長于30℃或37℃并在不同溫度下應(yīng)激的細(xì)胞在熱激條件下積聚的DnaK mRNA的定量。去飽和酶基因過量表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出顯著不同的mRNA積聚模式(與野生型細(xì)胞相反的模式)。數(shù)據(jù)來源于圖11的凝膠分析。
圖16為Northern印跡，顯示了遺傳修飾的沙門氏菌(Salmonella)細(xì)胞中DnaK(hsp70)和IbpB(hsp17)兩者mRNA積聚模式的相似變化，其在45℃應(yīng)激溫度下不誘導(dǎo)任何基因，但是他們在30℃表達(dá)。野生型細(xì)胞具有相反的行為。
過量表達(dá)的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)Δ12-去飽和酶，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下由于缺乏合適的底物而在細(xì)胞內(nèi)無酶活性，自身插入到膜脂雙層中并導(dǎo)致沙門氏菌(Salmonella)中HSR的重置。在轉(zhuǎn)化細(xì)胞的膜中發(fā)現(xiàn)實(shí)質(zhì)上較高的膜蛋白含量，也就是，失衡的蛋白/磷脂比。作為另外的證據(jù)，去飽和酶轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不能恰當(dāng)?shù)亟蛹{這種額外的膜蛋白，表現(xiàn)出改變的熱相變性質(zhì)，即使是在非應(yīng)激條件下也表現(xiàn)大為提高的外膜通透性。失衡的膜組織(初始事件)引發(fā)復(fù)雜的補(bǔ)償機(jī)制，包括改變某些脂質(zhì)區(qū)域相變溫度以及外膜對小HSP家族成員，IbpA和IbpB的締合。結(jié)果，HSP表達(dá)模式強(qiáng)烈下降，并且反過來影響當(dāng)其遭遇到易感宿主時(shí)該修飾菌株的正確適應(yīng)機(jī)制。
實(shí)施例2膜干擾還可通過用藥物例如苯甲醇(BA)化學(xué)處理獲得。它產(chǎn)生與熱激基因(DnaK和GroEL)表達(dá)相似的或較其高的效果，盡管其效果是暫時(shí)的，下面的實(shí)施例將解釋這點(diǎn)。
所用的濃度(不超過50mM)對沙門氏茵(Salmonella)的生長沒有毒性作用(圖17)。圖18表明50mM BA濃度時(shí)，生長于30℃的細(xì)胞在42℃積聚DnaK的水平顯著下降。這些結(jié)果證明過量表達(dá)去飽和酶基因用遺傳學(xué)方法或者通過用BA化學(xué)處理獲得的膜干擾決定了沙門氏菌(Salmonella)積聚適量應(yīng)激蛋白能力的顯著變化。然而 遺傳學(xué)方法產(chǎn)生的膜干擾(參見實(shí)施例1)導(dǎo)致沙門氏菌(Salmonella)在被用來感染巨噬細(xì)胞系(J774，圖19)時(shí)完全和永久的喪失其毒力； 用BA處理沙門氏菌(Salmonella)因?yàn)樵趶纳L培養(yǎng)基中除去BA和膜生理重建而僅僅暫時(shí)降低其感染巨噬細(xì)胞的能力(圖20)。
實(shí)施例2.1完整的藍(lán)藻類細(xì)菌(cyanobacterium)集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去飽和酶基因被克隆到pG13載體中，受控于PG13啟動(dòng)子(圖21)(Barker等1998，1999)，并轉(zhuǎn)化到野生型強(qiáng)毒瘰疬分枝桿菌(M.marinum)菌株中。在正常生長時(shí)或在感染巨噬細(xì)胞期間及在對感染易感的動(dòng)物中，可以用能夠驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)的其他啟動(dòng)子取代PG13。轉(zhuǎn)化株是用pG13Δ12載體永久遺傳修飾的生物體，并且具有提高水平的Δ12-去飽和酶mRNA，其被高水平地翻譯為Δ12-去飽和酶基因編碼蛋白。Δ12-去飽和酶mRNA在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)顯示于圖22。集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去飽和酶基因的引入和表達(dá)不影響細(xì)胞的生長(圖23)。Δ12-去飽和酶蛋白的引入和過量表達(dá)決定了用含處于PG13啟動(dòng)子調(diào)控之下的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去飽和酶基因的pG13Δ12轉(zhuǎn)化的瘰疬分枝桿菌(M.marinum)總膜分級(jí)分離物中的蛋白/脂質(zhì)比增加大約40％(圖24)。圖25顯示了用含處于PG13啟動(dòng)子調(diào)控之下的集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去飽和酶基因的pG13Δ12轉(zhuǎn)化的瘰疬分枝桿菌(M.marinum)的存活終止，而對照細(xì)胞的生長按照預(yù)期得以恢復(fù)。
實(shí)施例3.完整的莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)強(qiáng)毒G217B菌株的Δ9-去飽和酶基因被克隆到pWU44載體中(Woods和Goldman，1993)，受真菌莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)Downs菌株的上調(diào)Δ9-去飽和酶啟動(dòng)子的調(diào)控(Gargano等1995)，并利用它來轉(zhuǎn)化莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)強(qiáng)毒G217B菌株。這種修飾菌株命名為D3。其他啟動(dòng)子可取代這種在正常生長時(shí)或在感染巨噬細(xì)胞和動(dòng)物期間能夠表達(dá)下游基因的啟動(dòng)子。這樣轉(zhuǎn)化的菌株是遺傳修飾的生物體，過表達(dá)提高水平的Δ9-去飽和酶mRNA，后者最終被高水平地翻譯為相應(yīng)的蛋白。由于Δ9-去飽和酶蛋白的過量表達(dá)所致的MPS干擾改變熱激基因(例如hsp70)表達(dá)的最佳溫度，在34℃和42℃間及在宿主細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中存在的不利條件下，其積聚HSP的模式發(fā)生顯著變化(圖26)。這些結(jié)果一致說明，用遺傳方法通過過量表達(dá)去飽和酶基因或者局部或廣泛改變MPS的膜蛋白獲得的膜干擾，會(huì)導(dǎo)致莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)(以及其他原核和真核胞內(nèi)和胞外病原體)積聚適量應(yīng)激蛋白的能力顯著改變。這樣獲得的膜干擾導(dǎo)致被遺傳轉(zhuǎn)化的莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)在被用來感染來自Balb CD-11小鼠脛骨的巨噬細(xì)胞時(shí)完全和永久地喪失其毒力。圖27顯示，D3菌株不能在鼠源巨噬細(xì)胞中生長。以5×10/ml的濃度用強(qiáng)毒性G217B酵母菌株注射的Balb CD-11小鼠在5天之內(nèi)死亡，而用相似量的被遺傳修飾的減毒D3菌株酵母細(xì)胞注射的那些小鼠存活至少45天。此外，這種小鼠，如果在第45天后用強(qiáng)毒G217B菌株攻擊，則表現(xiàn)出至少60％的存活率(圖28)。
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序列表<110> Brane Tech S.r.l.
<120> 通過永久性遺傳修飾其生物膜而由病原微生物產(chǎn)生非強(qiáng)毒微生物用于制備疫苗的方法<130> 2810pt<160> 4<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1489<212> DNA<213> 集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803(Synechocystis PCC6803)<400> 1aattcagaag caattcggtt cctggtcaat ggcaacgtgt tataaaaaga aaagtttgtt60tacctgagta ttaattccta ggcacggcaa accttggccg ctttatagcc catgaatcca120taaacaaaat ctgtccgacc ttccatttgg agataaacct ttataaatga ctgccacgat180tcccccgttg acaccaacgg taacgcccag caatcccgat cgcccgattg cggatctcaa240actacaagac atcattaaaa ccctgcccaa ggaatgcttc gagaaaaaag cgagcaaagc300ctgggcttct gttttgatta ccctaggggc gatcgccgtg ggctatttgg gcattattta360tctgccctgg tactgcttgc ccattacctg gatctggaca gggacagcct taacgggggc420cttcgttgtc ggccatgact gtggccatcg ctcctttgct aaaaaacgct gggtcaatga480tttagtggga catatcgctt ttgctcccct catctaccct ttccatagct ggcgcctact540ccacgaccac catcacctcc acaccaacaa aattgaggtt gataacgcct gggatccctg600gagtgtggaa gctttccaag ccagcccggc gatcgtccgg cttttttatc gggccatccg660gggtcccttc tggtggactg gttccatttt ccattggagc ttaatgcact tcaaactttc720caactttgcc caaagggacc gcaataaagt caaattatcc attgccgttg tcttcctgtt780tgcggcgatc gcctttcctg ccctaattat caccacaggg gtgtggggtt tcgtcaaatt840ttggctaatg ccctggttgg tgtatcactt ttggatgagc acttttacca ttgtgcacca900caccattccc gaaattcgtt tccgtcccgc cgccgattgg agtgccgccg aagcccagtt960aaatggtact gttcactgcg attatccccg ttgggtggaa gtgctctgcc atgacatcaa1020cgtccatatt ccccaccacc tctccgttgc catcccttcc tataacctac gactagccca1080cggaagttta aaagaaaact ggggaccttt tctttacgag cgcaccttta actggcaatt1140aatgcaacaa attagtgggc aatgtcattt atatgacccc gaacatggct accgcacctt1200cggctccctg aaaaaagttt aatactggga caactagtaa tttttgaccc atgattggtc1260agtaattaac tttgactgat ccccagggag agaaatacca gatcacaaat taactatctt1320ggaatgcggc catcgagctg tattcctttt ttcttttctt ggtgaggaaa aaaactttct1380aagtgggcag atgggagcgg ttcagactag aaagatccac tcggccaaaa tgaatgctaa1440acgcaacctg catattctcc aaggttttca ctagccaagg taccccttc1489
<210> 2<211> 351<212> PRT<213> 集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803<400> 2Met Thr Ala Thr Ile Pro Pro Leu Thr Pro Thr Val Thr Pro Ser Asn1 5 10 15Pro Asp Arg Pro Ile Ala Asp Leu Lys Leu Gln Asp Ile Ile Lys Thr20 25 30Leu Pro Lys Glu Cys Phe Glu Lys Lys Ala Ser Lys Ala Trp Ala Ser35 40 45Val Leu Ile Thr Leu Gly Ala Ile Ala Val Gly Tyr Leu Gly Ile Ile50 55 60Tyr Leu Pro Trp Tyr Cys Leu Pro Ile Thr Trp Ile Trp Thr Gly Thr65 70 75 80Ala Leu Thr Gly Ala Phe Val Val Gly His Asp Cys Gly His Arg Ser85 90 95Phe Ala Lys Lys Arg Trp Val Asn Asp Leu Val Gly His Ile Ala Phe100 105 110Ala Pro Leu Ile Tyr Pro Phe His Ser Trp Arg Leu Leu His Asp His115 120 125His His Leu His Thr Asn Lys Ile Glu Val Asp Asn Ala Trp Asp Pro130 135 140Trp Ser Val Glu Ala Phe Gln Ala Ser Pro Ala Ile Val Arg Leu Phe145 150 155 160Tyr Arg Ala Ile Arg Gly Pro Phe Trp Trp Thr Gly Ser Ile Phe His165 170 175Trp Ser Leu Met His Phe Lys Leu Ser Asn Phe Ala Gln Arg Asp Arg180 185 190Asn Lys Val Lys Leu Ser Ile Ala Val Val Phe Leu Phe Ala Ala Ile195 200 205Ala Phe Pro Ala Leu Ile Ile Thr Thr Gly Val Trp Gly Phe Val Lys210 215 220Phe Trp Leu Met Pro Trp Leu Val Tyr His Phe Trp Met Ser Thr Phe225 230 235 240Thr Ile Val His His Thr Ile Pro Glu Ile Arg Phe Arg Pro Ala Ala245 250 255
Asp Trp Ser Ala Ala Glu Ala Gln Leu Asn Gly Thr Val His Cys Asp260 265 270Tyr Pro Arg Trp Val Glu Val Leu Cys His Asp Ile Asn Val His Ile275 280 285Pro His His Leu Ser Val Ala Ile Pro Ser Tyr Asn Leu Arg Leu Ala290 295 300His Gly Ser Leu Lys Glu Asn Trp Gly Pro Phe Leu Tyr Glu Arg Thr305 310 315 320Phe Asn Trp Gln Leu Met Gln Gln Ile Ser Gly Gln Cys His Leu Tyr325 330 335Asp Pro Glu His Gly Tyr Arg Thr Phe Gly Ser Leu Lys Lys Val340 345 350<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>3caaattatga ccctgttgat cagt 24<210>4<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>4cccccccatatgactgccac gattc 2權(quán)利要求
1.將病原微生物轉(zhuǎn)化為非強(qiáng)毒微生物的方法，包括步驟在所說的病原體中誘導(dǎo)遺傳修飾，以使它們誘導(dǎo)它們所接觸的宿主細(xì)胞的生物膜的物理學(xué)和/或動(dòng)力學(xué)狀態(tài)發(fā)生改變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中宿主細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，或者，一般而言，高等真核生物、特別是哺乳動(dòng)物、更具體的是人類的另外類型的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中膜狀態(tài)的改變在病原體中導(dǎo)致至少一個(gè)如下效應(yīng)應(yīng)激蛋白合成下降、膜脂組成改變、膜蛋白/脂質(zhì)比改變、膜相狀態(tài)、物理秩序和通透性改變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中遺傳修飾是按照如下主要步驟獲得的構(gòu)建包含處于啟動(dòng)子調(diào)控之下的基因的載體，該啟動(dòng)子調(diào)節(jié)蛋白產(chǎn)物的表達(dá)，該蛋白產(chǎn)物能夠修飾該載體所插入的病原體的膜的物理學(xué)和/或動(dòng)力學(xué)狀態(tài)；用這種載體遺傳轉(zhuǎn)化病原體；用這樣的載體表達(dá)該蛋白產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中構(gòu)建載體以便使其含有選自下組中的至少一個(gè)基因應(yīng)激基因、去飽和酶基因、毒力基因、其產(chǎn)物為膜結(jié)合蛋白的基因、其激活由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中其激活由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)的基因?yàn)閏-fos、fos B、junB、junD。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中蛋白產(chǎn)物通過在所述載體中插入選自下組的至少一個(gè)基因而獲得Δ12-去飽和酶基因、Δ9-去飽和酶基因、Δ6-去飽和酶基因、其他去飽和酶基因、編碼整合膜蛋白的基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中蛋白產(chǎn)物能夠直接或間接地與膜相互作用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中直接效應(yīng)歸因于整合膜蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中間接效應(yīng)歸因于修飾膜脂肪酸和磷脂的不飽和度水平的酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中間接效應(yīng)歸因于改變膜蛋白/脂質(zhì)比的蛋白的直接效應(yīng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中直接效應(yīng)歸因于改變膜通透性的蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中直接效應(yīng)歸因于改變膜的熱相變性質(zhì)的蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中病原微生物選自嚴(yán)格胞內(nèi)細(xì)菌、兼性胞內(nèi)細(xì)菌、真菌和寄生蟲以及非胞內(nèi)病原體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中病原微生物選自衣原體屬(Chlamydia)物種，例如肺炎衣原體(C.pneumoniae)和沙眼衣原體(C.trachomatis)、伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)、恰非埃里希氏體(Ehrlichia chaffeensis)、立克次氏體屬(Rickettsiae)；侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)，例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)、諾卡氏菌屬(Nocardia)物種(足分枝菌病)、巴爾通氏體屬(Bartonella)物種、布魯氏菌屬(Brucella)物種、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、沙門氏菌屬(Salmonella)物種、志賀氏菌屬(Shigella)物種；布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(萊姆病)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、奈瑟氏球菌屬(Neisseriae)物種、葡萄球菌屬(Staphylococci)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、耶爾森氏菌屬(Yersiniae)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)；煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、假絲酵母菌屬(Candida)物種、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)；溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)、利什曼原蟲屬(Leishmania)物種、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和間日瘧原蟲(P.vivax)、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、克魯斯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)。
16.制備減毒的非強(qiáng)毒病原微生物的方法，所述微生物選自鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)和莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)，其特征在于以下步驟構(gòu)建載體；用這種載體轉(zhuǎn)化病原體，該載體受在病原體感染期間調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)的啟動(dòng)子的控制，表達(dá)下列基因之一藍(lán)藻類細(xì)菌集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去飽和酶基因或強(qiáng)毒莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)G217B菌株的Δ9-去飽和酶基因、釀酒酵母(S.cerevisiae)或莢膜組織胞漿菌(H.capsulatum)Δ9-去飽和酶基因、或原核或真核生物體的其他去飽和酶基因、或其他編碼導(dǎo)致所述生物膜物理學(xué)和/或動(dòng)力學(xué)狀態(tài)干擾的整合膜蛋白的基因；過量表達(dá)該插入的基因。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中啟動(dòng)子是Downs菌株的上調(diào)啟動(dòng)子。
18.用根據(jù)權(quán)利要求16-17的方法獲得的沙門氏菌(Salmonella)，其特征在于分離的外膜的蛋白/脂質(zhì)比在強(qiáng)毒株中大約為100，而在遺傳修飾株中為170。
19.用根據(jù)權(quán)利要求16-17的方法獲得的瘰疬分枝桿菌(M.marinum)，其特征在于遺傳修飾株中分離的外膜的蛋白/脂質(zhì)比增加40％。
20.用根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得的病原微生物，其特征在于其毒力機(jī)理減弱但具有完全的免疫活性。
21.用根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得的修飾微生物，用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
22.用根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得的修飾微生物，用于制備疫苗。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-22的修飾微生物制備疫苗的用途。
24.包含作為活性成分的有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的修飾微生物與合適的賦形劑和添加劑組合的疫苗。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的疫苗，其中所述微生物選自衣原體屬(Chlamydia)物種，例如肺炎衣原體(C.pneumoniae)和沙眼衣原體(C.trachomatis)，伯氏考克斯氏體(Coxiella burnetii)、恰非埃里希氏體(Ehrlichia chaffeensis)、立克次氏體屬(Rickettsiae)；侵肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、分枝桿菌屬(Mycobacteria)，例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)、麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)、諾卡氏菌屬(Nocardia)物種(足分枝菌病)、巴爾通氏體屬(Bartonella)物種、布魯氏菌屬(Brucella)物種、土拉熱弗朗西絲氏菌(Francisellatularensis)、單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、沙門氏菌屬(Salmonella)物種、志賀氏菌屬(Shigella)物種；布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)(萊姆病)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、問號(hào)鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)、奈瑟氏球菌屬(Neisseriae)物種、葡萄球菌屬(Staphylococci)、釀膿鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)、無乳鏈球菌(S.agalactiae)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、耶爾森氏菌屬(Yersiniae)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)；煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、假絲酵母菌屬(Candida)物種、新型隱球酵母(Cryptococcusneoformans)、莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)；溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoebahistolytica)、利什曼原蟲屬(Leishmania)物種、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和間日瘧原蟲(P.vivax)、鼠弓形體(Toxoplasma gondii)、克魯斯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)以及相關(guān)組合。
26.根據(jù)權(quán)利要求24-25的疫苗，配制成皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜內(nèi)、經(jīng)鼻、陰道、口服和直腸給藥。
全文摘要
我們在這里描述了一種通過永久性遺傳修飾其膜物理狀態(tài)(MPS)而由病原微生物產(chǎn)生非強(qiáng)毒微生物的方法學(xué)。從而，在侵染之初，在這些修飾的生物體中，當(dāng)它們侵染宿主(如高等真核生物，特別是哺乳動(dòng)物的靶細(xì)胞，更具體的是人類細(xì)胞)，或者將其注射到動(dòng)物侵染模型中，熱激(應(yīng)激)基因表達(dá)和其編碼蛋白(應(yīng)激蛋白或HSP)積累以及其他物種特異性基因產(chǎn)物積累時(shí)，作為MPS修飾的結(jié)果，其調(diào)控被改變。除此之外，我們還提到由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑所介導(dǎo)調(diào)控的基因。所以，作為這一措施的結(jié)果，病原體成為非強(qiáng)毒的(減毒活生物體)，可用于疫苗制備。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1516735SQ02810864
公開日2004年7月28日 申請日期2002年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月30日
發(fā)明者R·辛克布萊尼, S·克羅納羅馬諾, R 辛克布萊尼, 弈陜蘼砼 申請人:布瑞恩技術(shù)有限責(zé)任公司