專(zhuān)利名稱(chēng)：三種α型芋螺多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種α型芋螺多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芋螺屬腹足綱軟體動(dòng)物，全世界約有500余種，遍布世界各暖海區(qū)，我國(guó)有芋螺 100多種，主要分布在我國(guó)的西沙群島、海南島及臺(tái)灣海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊內(nèi)壁的毒腺所分泌，每種芋螺的毒液中含50-200個(gè)活性多肽，不同品種芋螺所含的活性肽各不相同，即使同種芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差異，理論上估計(jì)約存在5萬(wàn)多種不同活性的多肽(Mcintosh, J. Μ.，Jones, R. Μ. (2001). Cone venom-from accidental stings to deliberate injection. Toxicon,39,1447-1451. Nelson, L. (2004). Venomous snails :0ne slip, and you，re dead. Nature，429，798-799.)。芋螺多肽能特異性作用于乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)的各種受體亞型，以及鈣、鈉和鉀等多種離子通道，不僅可以直接作為藥物，還可以作為理想的分子模型用于開(kāi)發(fā)新藥的先導(dǎo)化合物。其中，ω型芋螺多肽MVIIA 已被FDA批準(zhǔn)作為治療HIV和晚期癌癥痛的藥物進(jìn)入市場(chǎng)；從中國(guó)南海線(xiàn)紋芋螺中發(fā)現(xiàn)的 S0-3 也具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性(Dai qy et al. J Nat Prod 2003，66 (9) 1，276-9 ；專(zhuān)利 Zl 00128525. 4)。但上述兩種芋螺多肽作用于中樞神經(jīng)的N-型鈣通道，給藥方式為鞘內(nèi)，不方便使用。α -芋螺多肽(α -CTX)屬于芋螺多肽A超家族(按信號(hào)肽保守序列及二硫鍵排列模式芋螺多肽分為Α，Μ, 0，P，I，J，S，T等超家族)，特異作用于肌肉型及神經(jīng)元型nAChRs。 絕大多數(shù)α-芋螺多肽含12-18個(gè)氨基酸、兩對(duì)二硫鍵(CCXmCXnC,連接方式為1_3，2_4)。 根據(jù)m，η的數(shù)目不同，α -芋螺多肽細(xì)分為α 3/5，α 4/3，α 4/4，α 4/6，α 4/7亞家族。目前發(fā)現(xiàn)某些α-芋螺多肽具有鎮(zhèn)痛活性，其中α-芋螺多肽vci. i(gccsdprcnydhpeiconh2) 是來(lái)自維多利亞芋螺(Conus Victoriae)，由16個(gè)氨基酸組成，含兩對(duì)二硫鍵(二硫鍵的排列方式為 1-3，2-4) (Sandall et al. Biochemistry2003，42，6904-6911.)。研究表明 Vcl. 1在神經(jīng)性疼痛動(dòng)物模型中表現(xiàn)出了較好的鎮(zhèn)痛活性并具有加速損傷神經(jīng)恢復(fù)的作用 (Satkunanathan et al. Brain Res 2005，1059，149-158)，2006 年已進(jìn)入臨床研究階段。另一種α型芋螺多肽RgIa在動(dòng)物模型中同樣表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用。由此可見(jiàn)，α型芋螺多肽中存在某些具有較好鎮(zhèn)痛活性的多肽，它們對(duì)于開(kāi)發(fā)新一代神經(jīng)性疼痛的治療藥物具有重要意義，而且這些多肽可以采用皮下、肌肉或腹腔等給藥方式，大大方便了應(yīng)用。根據(jù)神經(jīng)損傷的病因、性質(zhì)和程度不同，在臨床上分為中樞神經(jīng)疼痛和外周神經(jīng)損傷所致的周?chē)窠?jīng)疼痛兩大類(lèi)。其中，中樞神經(jīng)疼痛簡(jiǎn)稱(chēng)中樞痛，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛傳導(dǎo)通路發(fā)生損害或功能障礙而引起的原發(fā)性疼痛，常見(jiàn)于脊髓的創(chuàng)傷、腦血管疾病或多發(fā)性硬化癥和腫瘤等。周?chē)窠?jīng)疼痛系外傷、缺血、壓迫、感染、炎癥或代謝等因素?fù)p傷外周神經(jīng)所致，如幻肢痛、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、多發(fā)性神經(jīng)炎、糖尿病性周?chē)窠?jīng)痛等。神經(jīng)性疼痛的典型癥狀包括感覺(jué)異常、痛覺(jué)過(guò)敏和痛覺(jué)超敏等。臨床上常用的藥物主要有抗驚厥藥(如萊提西酞、奧卡西平)、阿片類(lèi)藥(如嗎啡)和各種抗抑郁藥的聯(lián)用，但是由于毒副作用以及長(zhǎng)期用藥帶來(lái)的耐受性、成癮性等問(wèn)題，治療效果不佳(Dray et al, Br J Anaesth. 2008,101(1),48-58 ；Gilron et al, Expert Opin Emerg Drugs. 2007,12(1), 113-26.)。因此，發(fā)現(xiàn)新一代高活性、低耐受和非成癮的鎮(zhèn)痛藥物十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種α型芋螺多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的α型芋螺多肽為通式I所示的多肽；X^-Χ200Χβ—Χ4_-^-14^- ^通式 I通式I中&選自G、R中任意一個(gè)氨基酸或空缺；&選自G、N、K中任意一個(gè)氨基酸；&選自S、T、D、M中任意一個(gè)氨基酸；&選自N、R、I、F中任意一個(gè)氨基酸；&選自P、S、H中任意一個(gè)氨基酸；&選自A、F、D、T中任意一個(gè)氨基酸；X7選自M、K、Y、P、N中任意一個(gè)氨基酸；&選自L(fǎng)、R、N、I中任意一個(gè)氨基酸；X9選自K、I、D、Y中任意一個(gè)氨基酸；X10選自Y、N中任意一個(gè)氨基酸；X11選自P、R、S、K中任意一個(gè)氨基酸；)(12選自N、D、E、R、L中任意一個(gè)氨基酸；X13選自L(fǎng)、Q、F中任意一個(gè)氨基酸或空缺；X14選自N、Y中任意一個(gè)氨基酸或空缺；β選自酰胺基、或羧基；上述字母定義如下D_天冬氨酸；E-谷氨酸；I-異亮氨酸；K-賴(lài)氨酸；L-亮氨酸； M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-絲氨酸；T-蘇氨酸；G-甘氨酸；F-苯丙氨酸；P-脯氨酸；H-組氨酸；A-丙氨酸；Y-酪氨酸。所述多肽具體可為如下七種多肽中的任意一種多肽I 氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽II 氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽III 氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽IV 氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽V 氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VI 氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VII 氨基酸序列如序列表的序列13所示。
7個(gè)多肽的氨基酸序列如下
多肽tlnh2-gccsnpacmlknpnlc-conh2 ；
多肽t2:nh2-ncctrsfckriypdlc-conh2 ；
多肽t3nh2-gccdipdcynknreqc-conh2 ；
多肽jmnh2-nccmfhtcpidysrfnc-conh2 ；
多肽t5nh2-gnccmfhtcpidysrfnc-conh2 ；
多肽t6nh2-gnccmfhtcpιdysrfyc-conh2 ；
多肽t7nh2-rkccsnpacnrynklc-cooh。
所述多肽ii的制備方法具體如下化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列8所示且最后一-位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調(diào)節(jié)pH
值為8. 2，磁力攪拌Μ-4 !，得到多肽II。所述多肽III的制備方法具體如下化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列9所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，溶解于0. IM的 NH4HCO3緩沖液中，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8. 2，磁力攪拌對(duì)-4他，得到多肽III。所述多肽IV 的制備方法具體如下化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8. 2，磁力攪拌 Μ-4 !，得到多肽IV。所述多肽V的制備方法具體如下化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中， 用氨水調(diào)節(jié)PH值為8. 2，磁力攪拌M-4 !，得到多肽V。所述多肽VI的制備方法具體如下 化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽， 溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8. 2，磁力攪拌對(duì)-4他，得到多肽VI。 所述多肽I的制備方法具體如下化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列7所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，置于PH7. 70. IM Tris-HCl緩沖液中氧化^h，然后加入醋酸終止反應(yīng)，脫鹽凍干，然后與IOmM碘溶液避光反應(yīng)lOmin，得到多肽I。所述多肽VII的制備方法具體如下化學(xué)合成序列表的序列13所示的線(xiàn)性多肽，置于pH7. 70. IM Tris-HCl 緩沖液中氧化^h，然后加入醋酸終止反應(yīng)，脫鹽凍干，然后與IOmM碘溶液避光反應(yīng)lOmin， 得到多肽VII。所述多肽的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述多肽的編碼基因具體可為如下七種DNA片段中的任意一種(1)序列表的序列1自5’端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列2自5’端第142至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列3自5’端第133至180位核苷酸所示的DNA分子；(4)序列表的序列4自5，端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(5)序列表的序列5自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(6)序列表的序列6自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(7)序列表的序列7自5’端第133至180位核苷酸所示的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)一種用于鎮(zhèn)痛的藥物，其活性成分為以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽在制備用于鎮(zhèn)痛的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種鎮(zhèn)痛劑，為以上任一所述的多肽。以上任一所述的多肽或均可應(yīng)用于制備鎮(zhèn)痛劑。
上述α型芋螺多肽可采用Fmoc法固相合成，用高效液相色譜技術(shù)純化。經(jīng)過(guò)活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)通式I的7個(gè)多肽具有鎮(zhèn)痛作用，其中α芋螺多肽T_l、Τ_2、 Τ-3、Τ-4具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，Τ5-Τ7也有明顯鎮(zhèn)痛活性，在抑制鎮(zhèn)痛方面具有應(yīng)用價(jià)值。所述的α型芋螺多肽的衍生物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述的α型芋螺多肽的衍生物可為如下(I)、(II)、(III)或(IV)(I)將所述α型芋螺多肽進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入和/或替換和/或缺失， 得到的α型芋螺多肽的衍生物；(II)將所述α型芋螺多肽或⑴α型芋螺多肽的衍生物進(jìn)行環(huán)化、脂化或PEG化修飾，得到的α型芋螺多肽的衍生物；(III)將所述α型芋螺多肽或⑴α型芋螺多肽的衍生物與載體聯(lián)接，得到的α 型芋螺多肽的衍生物；(IV)將一個(gè)或幾個(gè)所述α型芋螺多肽或(I) α型芋螺多肽的衍生物連接為多聚體，得到的α型芋螺多肽的衍生物。所述的α型芋螺多肽中，可對(duì)側(cè)鏈氨基酸進(jìn)行修飾，這些殘基的修飾可以增強(qiáng)肽的生物活性或者靶向的選擇性。所述取代還可以是“保守性取代”或“非保守性取代”。取代可以是一個(gè)氨基酸的取代，也可以是多個(gè)氨基酸的取代，可以是連續(xù)的取代，也可以是分散的取代。“保守性取代”將所述的α型芋螺多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基用構(gòu)象為D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修飾的氨基酸替換，以增加生物利用度及提高抑制活性；D-型的氨基酸指與組成蛋白質(zhì)的L-型的氨基酸相對(duì)的氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括組成蛋白質(zhì)的不常見(jiàn)氨基酸和不組成蛋白質(zhì)的氨基酸，如5-羥基賴(lài)氨酸、甲基組氨酸、Y -氨基丁酸、高絲氨酸等；人工修飾的氨基酸指經(jīng)過(guò)甲基化，磷酸化等修飾的組成蛋白質(zhì)的常見(jiàn) L-型氨基酸?！胺潜Ｊ匦匀〈倍嚯闹械囊粋€(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基被不同性質(zhì)的氨基酸所取代，或者被非常規(guī)氨基酸所取代。所述添加，可以是一個(gè)氨基酸或者多個(gè)天然的或者非常規(guī)的氨基酸。所述缺失，也包括一個(gè)或者多個(gè)氨基酸的缺失。所述載體包括但是不局限于蛋白質(zhì)、聚乙二醇、脂類(lèi)物質(zhì)等。幾個(gè)(1-4個(gè))相同的α型芋螺多肽可通過(guò)氨基酸，如賴(lài)氨酸、半胱氨酸，或者其他的分子連接在一起形成多聚體。所述藥物中還可含有阿片受體拮抗劑、阿片受體部分激動(dòng)劑、去甲腎上腺素受體拮抗劑、α 2去甲腎上腺素受體激動(dòng)劑、膽堿能神經(jīng)拮抗劑、鈣通道阻斷劑或NMDA受體拮抗劑中的任意一種或幾種，以增強(qiáng)其鎮(zhèn)痛的效果。所述藥物中可添加藥劑學(xué)可接受的輔料，制成針劑、口服劑、直腸體給藥劑或皮膚吸收劑等不同劑型。本發(fā)明的α型芋螺多肽具有以下特點(diǎn)1、本發(fā)明的α型芋螺多肽具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，其中Τ-2、Τ-3、Τ_4四個(gè)肽在肌肉注射劑量在很低的情況下(lOnmol/kg)既可使痛閾率提高40%以上，T-I可使痛閾率提高 80%以上，T-5、T-6、T-7也可使痛閾提高20%以上。2、本發(fā)明的α型芋螺多肽來(lái)自中國(guó)南海芋螺，具有全新的氨基酸組成，與目前報(bào)道的α型芋螺多肽在氨基酸組成上具有顯著差異。3、本發(fā)明的α型芋螺多肽作用于外周神經(jīng)系統(tǒng)，給藥方式為皮下、肌肉或腹腔注射，與現(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物MVIIA的鞘內(nèi)給藥方式相比，應(yīng)用更便利。


圖1為Τ-2、Τ-3、Τ-4、Τ-5、Τ_6和Vcl. 1折疊24h后的色譜分析圖；A :T_2折疊圖； B :Τ-3折疊圖；C :Τ-4折疊圖；D :Τ-5折疊圖；E :Τ_6折疊圖；F =Vcl. 1折疊圖。圖2為T(mén)-l、Τ-7第一步折疊和第二步折疊后的色譜分析圖；A =T-I第一步氧化折疊圖；B =T-I第二步氧化折疊圖；C :Τ-7第一步氧化折疊圖；D :Τ-7第二步氧化折疊圖。圖3 為 T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T_7、Vcl. 1 多肽純化后的色譜分析圖；A =T-I 純化分析圖；B :T-2純化分析圖；C :Τ-3純化分析圖；D :Τ-4純化分析圖；E :Τ_5純化分析圖；F :Τ-6純化分析圖；G :Τ-7純化分析圖；H =Vcl. 1純化分析圖。圖4 為 T-l、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6、T_7、Vcl. 1 多肽的鎮(zhèn)痛活性。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。下述實(shí)施例中的％，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、α型芋螺多肽的發(fā)現(xiàn)1、芋螺總RNA的提取從西沙群島、海南三亞等地采集6種芋螺活體作為樣本材料，分別采用Trizol 法提取6種芋螺的總RNA。6種芋螺大理石芋螺(Conus marmoreus)、堂皇芋螺(Conus imperial is) > fW ^ili (Conus litteratus) > H ^ili (Conus emaciatus)、少女宇 累 (Conus eberneus)、小牛芋螺(Conus vitulinus)。Trizol法提取總RNA的具體步驟①先于冰上取芋螺毒腺管，將其置于液氮中冷凍并用研磨器研成粉末，倒入事先冰浴的微量勻漿器中。②吸取1. 2ml Trizol加入勻漿器并進(jìn)一步研磨使芋螺組織裂解釋放RNA。③將研磨好的漿液倒入1. 5ml的離心管中，室溫靜置5min。④加入20%氯仿240 μ 1，劇烈震蕩15s后，放于冰上lOmin。⑤4°C、12000rpm離心15min，小心轉(zhuǎn)移上清到一新的離心管中，加入高鹽沉淀液 250 μ 1、異丙醇250 μ 1，反復(fù)顛倒30次左右，再放于冰上IOmin。⑥ 4°C、12000rpm，離心 lOmin，棄去上清。⑦加入1. 2ml 75% 乙醇混勻，4°C、9045rpm 離心 5min。⑧棄去上清，空氣中干燥lOmin，加入50-80 μ 1 DEPC溶解沉淀，溶液即為RNA溶液，于-80°C保存?zhèn)溆谩?、cDNA 的合成采用大連iTaKafci公司的 3，F(xiàn)ull_RACE 試劑盒(3，-Full RACE Core Set Ver 2. 0)進(jìn)行cDNA的合成，具體方法如下按下列比例混合樣品
RNase Free ddH204. 5 μ 1
3，RACE Adaptor (5 μ Μ)1 μ 1
RNA (1. 5 μ g total RNA)1 μ 1 混勻后，70° C變性lOmin，冰上急冷^iin。
上述反應(yīng)溶液6. 5 μ 1
dNTP MixturedOmM each)1 μ 1
RNase Inhibitor0.25 μ 1
Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)0. 25 μ 15 X M-MLV Buffer2 μ 1混勻后，42°C反應(yīng)lh，70°C反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C保存。3、芋螺毒素cDNA的3，-RACE擴(kuò)增以步驟2合成的cDNA為模板，根據(jù)芋螺多肽A超家族α芋螺多肽信號(hào)肽區(qū)域設(shè)計(jì)α -CTX外側(cè)引物Fl和內(nèi)側(cè)引物F2，分別和3，-RACE外側(cè)引物Rl，3 ’ -RACE內(nèi)側(cè)引物R2 進(jìn)行巢式PCR。Fl :5’ -ATGGGCATGCGGATGATGTTC-3，；F2 :5， -CTGTTGGTTGTCTTGGCAACCAC-3，；Rl :5’ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，；R2 5 ’ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’。具體步驟第一輪PCR反應(yīng)體系包括反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板3 μ 1，1 X cDNA Dilution Buffer 117 μ 1，上游引物 Fl 2 μ 1，3，-RACE 夕卜側(cè)弓| 物 Rl 2 μ 1，10XLA PCR Buffer II (Mg2+plus) 5 μ LTaKaRa LA Taq (5U/ μ 1)0. 25 μ 1，用滅菌的去離子水補(bǔ)齊總體積 50 μ 1。 進(jìn)行PCR的循環(huán)條件為94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒 (桶形芋螺及密碼芋螺為lmin)，30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸lOmin，4°C保溫。第二輪PCR 反應(yīng)體系包括第一輪 PCR 產(chǎn)物 1 μ 1，dNTP Mixture (各 2. 5mM) 8 μ 1， 10XLA PCR Buffer II (Mg2+plus) 5 μ 1，3，-RACE 內(nèi)側(cè)引物 R2 2口1，下游引物卩2 2μ 1, TaKaRa LA Taq (5U/μ 1) 0. 5 μ 1，用滅菌的去離子水補(bǔ)齊總體積50 μ 1。進(jìn)行PCR的循環(huán)條件為94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒(桶形芋螺及密碼芋螺為lmin)，30個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸10min，4°C保溫。PCR產(chǎn)物取8 μ L點(diǎn)樣，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，在圖像分析儀下紫外透射觀(guān)察分析照相。4、PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序用膠回收試劑盒回收上述特異PCR產(chǎn)物(300bp-800bp)與載體連接，6種PCR產(chǎn)物與pGM-T載體(TIANGEN生物公司)連接；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，利用氨芐青霉素抗性挑選單克隆，37°C、220rpm進(jìn)行搖菌，再通過(guò)PCR法挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，PCR反應(yīng)體系為反應(yīng)菌液 1 μ 1，3，_RACE 內(nèi)側(cè)引物 R2 1口1，下游引物卩2 1 μ l,2XTaq PCRMaster Mix (Τ IANGEN 生物公司)12. 5 μ 1，ddH20 9. 5 μ 1，總反應(yīng)體系為25 μ 1，反應(yīng)條件同第二輪PCR的循環(huán)條件，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列的分析和比對(duì)，獲得了本發(fā)明所述通式I的新型α芋螺多肽序列。通式I的新型α芋螺多肽序列是根據(jù)前肽及芋螺毒素特點(diǎn)推測(cè)而來(lái)，前肽是根據(jù)前體基因推測(cè)而來(lái)。6種α芋螺多肽前肽序列見(jiàn)表1，6種α芋螺多肽前肽編碼的多核苷酸序列見(jiàn)表2。表1前肽序列
權(quán)利要求
1.如下(1)或(2)或(3)所示多肽(1)氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；(2)氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；(3)氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽的制備方法如下化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列10所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8. 2，磁力攪拌對(duì)-4他，得到⑴ 所示多肽；化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列11所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8. 2，磁力攪拌對(duì)-4他，得到⑵ 所示多肽；化學(xué)合成氨基酸序列如序列表的序列12所示且最后一位氨基酸殘基酰胺化的線(xiàn)性多肽，溶解于0. IM的NH4HCO3緩沖液中，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8. 2，磁力攪拌對(duì)-4他，得到(3) 所示多肽。
3.權(quán)利要求1或2所述多肽的編碼基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述多肽的編碼基因?yàn)槿缦?1)序列表的序列4自5，端第139至189位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表的序列5自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子；(3)序列表的序列6自5，端第136至189位核苷酸所示的DNA分子。
5.一種用于鎮(zhèn)痛的藥物，其活性成分為權(quán)利要求1或2所述的多肽。
6.權(quán)利要求1或2所述的多肽在制備用于鎮(zhèn)痛的藥物中的應(yīng)用。
7.一種鎮(zhèn)痛劑，為權(quán)利要求1或2所述的多肽。
8.權(quán)利要求1或2所述的多肽在制備鎮(zhèn)痛劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種α型芋螺多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了七種多肽多肽I氨基酸序列如序列表的序列7所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽II氨基酸序列如序列表的序列8所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽III氨基酸序列如序列表的序列9所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽IV氨基酸序列如序列表的序列10所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽V氨基酸序列如序列表的序列11所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VI氨基酸序列如序列表的序列12所示，且最后一位氨基酸殘基酰胺化；多肽VII氨基酸序列如序列表的序列13所示。經(jīng)過(guò)活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)通式I的7個(gè)多肽具有鎮(zhèn)痛作用，其中α芋螺多肽T-1、T-2、T-3、T-4具有顯著的鎮(zhèn)痛活性，T5-T7也有明顯鎮(zhèn)痛活性，在鎮(zhèn)痛方面具有應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P29/00GK102304171SQ20111025834
公開(kāi)日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月10日
發(fā)明者于正, 劉珠果, 吳巧玲, 孫婷, 戴秋云, 胡潔 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所