專利名稱：可用于檢測(cè)o組hiv－1病毒感染的生物試驗(yàn)的合成肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于檢測(cè)O組HIV-1病毒感染的生物試驗(yàn)的合成肽，它們的制備方法，包含這些肽的組合物和試劑盒以及使用這些肽的生物試驗(yàn)。
現(xiàn)有技術(shù)已知O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒。專利EPO,345,375和專利申請(qǐng)EPO,657,532描述了從卡麥隆病人分離的ANT 70和ANT 70 NA分離物。這些文獻(xiàn)更具體地描述了和包含這些分離物的裂解物或蛋白的抗原和抗原組合物，對(duì)應(yīng)于基因組RNA的核酸，使用這些核酸的雜交方法，制備上述分離物的方法以及制備這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的p12、p16、p25、gp41和gp120蛋白的方法。
申請(qǐng)EPO,591,914描述了MVP5180/91分離物。如以前的分離物，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡表征的該分離物顯示與已知很長(zhǎng)時(shí)間的HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒分離物有差異。申請(qǐng)EPO,591,914精確地描述了MVP5180/91分離物的DNA序列并精確地定位了gag，pol和env基因。申請(qǐng)EP 0,591,914進(jìn)一步描述了V3環(huán)的合成肽以及免疫顯性區(qū)(gp41)。它們可用于生物試驗(yàn)，尤其是用于體外檢測(cè)組O HIV-1抗體。
申請(qǐng)EP 0,673,948描述了由15-50個(gè)氨基酸(AA)組成并包含序列-VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR-的合成或重組肽，其中X代表半胱氨酸殘基或絲氨酸殘基。這些肽可用于診斷領(lǐng)域，用于檢測(cè)一些O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒分離物的感染。
還已知申請(qǐng)EP0,727,483描述了形成屬于O組HIV-1家族的逆轉(zhuǎn)錄病毒一部分的MVP2901/94分離物。該申請(qǐng)描述了一些具有充分確定的肽序列的抗原。這些肽序列對(duì)應(yīng)于MVP2901/94分離物的gp120序列的一部分和gp41的一部分(免疫顯性區(qū))。
申請(qǐng)WO96/12809描述了兩種屬于O組HIV-1家族的新的分離物。它們?yōu)閂AU和DUR分離物。該申請(qǐng)描述了一些來(lái)自上述兩種病毒的可用于檢測(cè)識(shí)別HIV-1 VAU或DUR肽序列的抗體的肽序列。
申請(qǐng)WO96/32293描述了來(lái)自ANT 70分離物序列的兩種抗原。它們?yōu)間p41的免疫顯性區(qū)的被稱為MDL061的抗原和抗原MDL056。根據(jù)本發(fā)明，為了檢測(cè)100％的來(lái)自被O組HIV-1病毒感染的病人的有限血清收集物的樣品，必須使用包含這兩種肽的組合物，因?yàn)槊糠N分離的肽其本身不能獲得滿意的結(jié)果。
的確，根據(jù)O組病毒分離物顯示的遺傳可變性，通過(guò)使用來(lái)自相同和唯一分離物的抗原保證感染個(gè)體的血清學(xué)篩選幾乎是不可能的。這意味著不可能獲得保證100％靈敏度的試劑。因此，O組首次成為重要問(wèn)題；即某血清學(xué)試劑不能充分識(shí)別被特別不同的組或亞類感染的個(gè)體。對(duì)于0組HIV-1病毒尤其是這種情況。
申請(qǐng)WO96/40763還強(qiáng)調(diào)O組的很大的差異性。該申請(qǐng)描述了將一些較小的修飾(一個(gè)或兩個(gè)氨基酸置換)摻入至天然B型HIV-1序列中的肽。根據(jù)該申請(qǐng)，這些雜合肽能與抗O組抗體反應(yīng)。
申請(qǐng)WO96/27013描述了一系列被稱為BCF01、BCF02、BCF03、BCF06、BCF07、BCF08、BCF09、BCF11、BCF12、BCF13和BCF14的新的O組HIV-1病毒以及一系列被稱為ESS/BCF02、FAN/BCF01、LOB/BCF06、M/AN/BCF07、NKO/BCF08、POC/BCF03、NAM/BCF11、BCF09、BCF12、BCF13和BCF14的相應(yīng)的gp41免疫顯性區(qū)的肽。由于其低溶解性，尤其是肽BCF13，許多這些肽難于在診斷中應(yīng)用。
出乎意料地，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)一些合成肽為具有優(yōu)異品質(zhì)的診斷試劑，它們使得能滿意地篩選被O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的病人。這些肽由在高度保守的短序列周圍連接的可變序列組成，所述保守序列存在于O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒所有分離物中。本發(fā)明的肽使得能獲得優(yōu)于用帶有一些O組HIV-1分離物的gp41(env)的免疫顯性表位的合成肽所獲得的結(jié)果。
以下將使用三字母命名法來(lái)命名氨基酸。
本發(fā)明的合成肽對(duì)應(yīng)于通式(I)Δ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ω(I)其中-Δ代表生物素殘基、生物胞素殘基、氫原子、乙?；?CH3CO-)、可含一個(gè)或兩個(gè)巰基、醛或胺官能基團(tuán)的脂族鏈，脂族鏈優(yōu)選為1至6個(gè)碳原子的烷基鏈或2至6個(gè)碳原子的鏈烯基鏈，或2至6個(gè)碳原子的氨基烷基羰基鏈，-Z代表式(II)-(X)之一的肽序列-Ξ1-Ser-Ξ2- (II)-Ser-Ξ2- (III)-Ξ1-Ser- (IV)-Ξ1-Gln-Ξ2- (V)-Gln-Ξ2- (VI)-Ξ1-Gln- (VII)-Ξ1-Asn-Ξ2- (VIII)-Asn-Ξ2- (IX)Ξ1-Asn-(X)其中-Ξ1代表0-9個(gè)氨基酸的肽序列，和-Ξ2代表0-5個(gè)氨基酸的肽序列，-Θ代表式(XI)的肽序列-(AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5)-(XI)其中·(AA1)代表賴氨酸或精氨酸殘基，或鳥(niǎo)氨酸殘基，·(AA2)代表甘氨酸殘基或天冬酰胺殘基，·(AA3)代表賴氨酸或精氨酸殘基，或鳥(niǎo)氨酸殘基，·(AA4)代表亮氨酸殘基，或丙氨酸殘基或異亮氨酸殘基或谷氨酰胺殘基，
·(AA5)代表異亮氨酸殘基，或纈氨酸殘基或亮氨酸殘基或蘇氨酸殘基，或正亮氨酸殘基或正纈氨酸殘基，前提是(AA1)、(AA2)、(AA3)、(AA4)和(AA5)不一起形成肽序列-LysGlyLysLeuIle和-LysGlyLysLeuVal-，與絲氨酸的-CO-基團(tuán)相連的Ω代表-羥基(-OH)基團(tuán)或氨基(-NH2)基團(tuán)，-包含1-6碳原子的烷氧基基團(tuán)，-式(XII)的肽序列-Val-Σ-Ψ(XII)其中Σ代表式(XIII)或式(XIV)序列-(AA6)-Trp Asn-(AA7)-(AA8)(XIIIH)-(AA6)-Trp His-(AA7)-(AA8)(XIV)其中·(AA6)代表不同于賴氨酸的氨基酸，·(AA7)代表一個(gè)氨基酸，·(AA8)代表絲氨酸或蘇氨酸殘基，與游離AA8氨基酸的-CO-殘基相連的Ψ代表OH或NH2基團(tuán)或包含1-6個(gè)碳原子的烷氧基基團(tuán)，-式(XV)的肽序列-Val-Ψ(XV)其中與纈氨酸-CO-殘基相連的Ψ具有如式(XII)中相同的含義，-或式(XVI)-(XVIII)之一的肽序列-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ψ (XVI)Val-Σ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ (XVII)Val-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Ψ(XVIII)
其中Z和Θ具有式(I)給定的定義，Σ具有式(XII)給定的定義，與絲氨酸的-CO-殘基、AA8氨基酸的-CO-殘基或纈氨酸的-CO-殘基相連的Ψ具有如式(XII)中相同的含義。
當(dāng)Ω代表式(XVI)-(XVIII)之一的肽序列時(shí)，式(I)的肽變?yōu)槠浯笮】蓮?6變化至66個(gè)氨基酸的二聚體。當(dāng)Ω不代表式(XVI)-(XVIII)之一的肽序列時(shí)，式(I)的肽為單體類型并且其大小可從13個(gè)氨基酸變化為33個(gè)。
本發(fā)明的肽可為線性形式或?yàn)橥ㄟ^(guò)半胱氨酸之間的二硫橋環(huán)化的形式。
優(yōu)選其中(AA5)代表纈氨酸殘基，或亮氨酸殘基或蘇氨酸殘基的式(I)化合物，并且當(dāng)Ω對(duì)應(yīng)于式(XII)的肽序列時(shí)，(AA6)代表谷氨酰胺或精氨酸殘基。
優(yōu)選式(I)的肽，其中-Δ代表生物素殘基、氫原子、可包含一個(gè)或兩個(gè)巰基、醛或胺官能基團(tuán)的脂族鏈，脂族鏈優(yōu)選為1至6個(gè)碳原子的烷基鏈，或2至6個(gè)碳原子的氨基烷基羰基鏈，-Z代表式(II)或(V)的肽序列—其中Ξ1代表兩個(gè)氨基酸的肽序列和Ξ2代表一個(gè)氨基酸，或式(IV)的序列—其中Ξ1代表三個(gè)氨基酸，或式(VIII)的肽序列—其中Ξ1代表九個(gè)、八個(gè)或三個(gè)氨基酸的肽序列和Ξ2代表五個(gè)氨基酸的肽序列，-Θ代表下式的肽序列-Lys Gly Arg Leu Val-，-Arg Gly Lys Ala Val-，-Arg Gly Arg Leu Val-，或-Arg Gly Arg Ala Val-，和-Ω代表羥基、肽序列(XV)或?qū)?yīng)于式(XII)肽序列的下列序列之一-Val Arg Trp Asn Glu Thr-Ψ，-Val Gln Trp Asn Glu Thr-Ψ
或-Val Gln Trp Asn Ser Thr-Ψ.
優(yōu)選地，Z代表下式的肽序列· -Leu Leu Ser Ser-· -Leu Leu Asn Ser-· -Leu Leu Gln Ser-· -Arg Leu Asn Ser-· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-· -Leu Asn Gln Gln Arg Leu LeuAsn Ser-或·-Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-同樣形成本發(fā)明一部分的是包含20至50個(gè)氨基酸并對(duì)應(yīng)于式(Ia)的合成肽Δ-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ωa(Ia)其中Za代表式IIa-Xa的基團(tuán)Ξ1a-Ser-Ξ2a(IIa)-Ser-Ξ2a(IIIa)-Ξ1a-Ser (IVa)Ξ1a-Gln-Ξ2a(Va)-Gln-Ξ2a(VIa)Ξ1a-Gln- (VIIa)Ξ1a-Asn-Ξ2a(VIIIa)-Asn-Ξ2a(IXa)-Ξ1a-Asn (Xa)其中-Ξ1a代表1-15個(gè)氨基酸的肽序列，和-Ξ2a為一個(gè)氨基酸，-Ωa如式(I)所定義代表式(XII)的肽序列，或式(XVIIa)的肽序列Val-Σ-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ (XVIIa)其中Za具有式(Ia)指定的含義，及Δ、Θ、Σ和Ψ具有如式(I)的相同含義。
優(yōu)選包含下面序列的式(I)或(Ia)的肽(這些肽可為如上所定義的二聚體形式或單體形式)。根據(jù)一字母和三字母命名法給出序列。
序列No.1-LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22序列No.2-LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22序列No.3-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22序列No.4-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Ser Thr-22
序列No.5-LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST-或-Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Ser Thr-22序列No.6-LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22序列No.7-LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Gys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22序列No.8-LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22
序列No.9-LLSSWGCKGRLVCYTS-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser-1 5 10 15序列No.10-LLNSWGCKGRLVCYTS-或-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser-1 5 10 15序列No.11-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30序列No.12-ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30
序列No.13-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30序列No.14-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr1 5 10 15Thr Ser Val-20序列No.15-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys1 5 10 15Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-20 25序列No.16-RLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-1 5 10 15下列合成肽是特別優(yōu)選的肽
肽No.1(2B)SEQ ID No.1LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.2(3B)SEQ ID No.2LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.3(4B)SEQ ID No.3LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.4(5B)SEQ ID No.4LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Ser Thr22
肽No.5(6B)SEQ ID No.5LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST或Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Ser Thr22肽No.6SEQ ID No.6LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET或Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.7SEQ ID No.7LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.8(7B)SEQ ID No.8LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22
肽No.9(12B)SEQ ID No.9LLSSWGCKGRLVCYTS或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15肽No.10(14B)SEQ ID No.10LLNSWGCKGRLVCYTS或Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15肽No.11(18B)SEQ ID No.11ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET或Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30肽No.12(19B)SEQ ID No.12ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET或Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30
肽No.13(20B)SEQ ID No.13ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30肽 No.14(21B)SEQ ID No.14LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV或Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr1 5 10 15Thr Ser Val20肽No.15(22B)SEQ ID No.15RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV或Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys1 5 10 15Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val20 25肽 No.16(23B)SEQ ID No.16RLNSWGCKGRLVCYTSVorArg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val1 5 10 15
可按照常規(guī)方法通過(guò)固相合成獲得作為本發(fā)明主題的式(I)的合成肽R.B.Merrifield，美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(1963)，85，pp.2149-2154；R.C.Sheppard，“肽1971”，Nesvadba H.(編)北荷蘭，阿姆斯特丹，pp.111；E.Atherton和R.L.Sheppard，“固相肽合成，實(shí)用方法”，IRL PRESS(1989)，Oxford University Press，pp.25-34。作為自動(dòng)合成儀，可使用來(lái)自Millipore的合成儀“9050 Plus Pep Synthesizer”或等同的合成儀。
用于合成的固相載體應(yīng)與所使用的技術(shù)和化學(xué)性質(zhì)相容。例如，對(duì)于在合成儀“9050 Plus Pep.Synthesizer”上合成，推薦使用適宜于所謂的“連續(xù)流動(dòng)”技術(shù)的樹(shù)脂；PEG PS樹(shù)脂滿足這些標(biāo)準(zhǔn)。這些載體由位于聚苯乙烯珠功能團(tuán)和第一個(gè)氨基酸的連接點(diǎn)之間的基于聚乙二醇(PEG)的臂(間隔臂)組成。該錨定點(diǎn)的特性可根據(jù)所選擇的C-末端官能基團(tuán)而變化。在本發(fā)明的情況下，使用各種PEG-PS樹(shù)脂。
起始樹(shù)脂和作為原料使用的氨基酸為有商業(yè)供應(yīng)的產(chǎn)品(PerSeptive-Biosystem，或Néosystem)。
對(duì)于肽合成，使用了下面的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)
所用氨基酸的α位的伯胺官能基團(tuán)的暫時(shí)的保護(hù)為9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基團(tuán)。用20％的哌啶/二甲基甲酰胺溶液進(jìn)行去保護(hù)。
為了偶聯(lián)，優(yōu)選使用過(guò)量的二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)和1-羥基苯并三唑(HOBt)。
合成后，將樹(shù)脂用有機(jī)溶劑(二甲基甲酰胺，接著是二氯甲烷)洗滌，真空干燥并接著用冷卻至0℃并包含適宜“清除劑”的三氟乙酸(TFA)溶液處理?？墒褂美绨?2％三氟乙酸、5％苯酚、5％水、5％苯甲硫醚和3％乙二硫醇的K試劑。
過(guò)濾樹(shù)脂后，沉淀合成的肽并用乙醚漂洗。
通過(guò)反向液相色譜純化合成的肽，通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定其純度。作為固定相，可使用例如Bondapak C-18相。通過(guò)在兩種緩沖液中形成線性梯度來(lái)洗脫肽，第一種本質(zhì)上為水溶液(例如水-0.1％TFA)，第二種近乎有機(jī)溶液(例如包含60％乙腈，39.92％水和0.08％TFA的混合物)?；旌鲜占募兊募?jí)分，真空濃縮并冷凍。
為了環(huán)化，將純化的合成肽溶解在乙酸銨溶液(10mM)中。通過(guò)加入1M氫氧化銨將pH調(diào)至8.5。劇烈攪拌溶液。18小時(shí)后完成環(huán)化。通過(guò)加入乙酸將pH降至6。將環(huán)化的肽冷凍干燥，接著如上所述通過(guò)反向液相色譜純化。
借助于主要為卡麥隆來(lái)源的被O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的病人的血清來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明肽的免疫反應(yīng)性。進(jìn)行的各種試驗(yàn)表明，本發(fā)明的肽單獨(dú)或結(jié)合(肽的組合物)使得能檢測(cè)100％的被O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的血清。
因此本發(fā)明的合成肽在用于檢出O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的免疫試驗(yàn)中找到了應(yīng)用。還可使用一些式I的合成肽的組合?？砂瑑煞N或多種式I肽的這些組合也組成本發(fā)明的一部分。優(yōu)選包含肽No.1(2B)和No.3(4B)的組合。
還可與可通過(guò)常規(guī)方法獲得的并具有例如申請(qǐng)EPO,591,914中描述的序列的O組HIV-1重組肽(重組蛋白)結(jié)合使用本發(fā)明式(I)的合成肽。這些組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的合成肽還可與其它HIV-2和/或HIV-1重組(重組蛋白)或合成肽，如專利申請(qǐng)或?qū)＠鸈PO,387,914，EPO,239,425，EPO,220,273或EPO,267,802中描述的肽結(jié)合使用。這些專利申請(qǐng)或?qū)＠皇歉F舉性的，只是給出作為實(shí)例。
包含一種或多種式(I)合成肽和一種或多種HIV-1或HIV-2重組或合成肽的組合物在用于檢出被各種HIV逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的病人的診斷中找到了應(yīng)用。這些組合物也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
單獨(dú)或與O組HIV-1重組肽或HIV-1和/或HIV-2重組或合成肽結(jié)合使用一種或多種式(I)的合成肽的免疫分析也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還涉及用于進(jìn)行免疫分析的包括式(I)肽的試劑盒或包含至少一種式(I)肽的組合物。
下面的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明但并是不限制性的。實(shí)施例1本發(fā)明的化合物的制備肽No.2(3B)LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22在固相上合成該肽。由Merrified于1963年開(kāi)發(fā)的技術(shù)(美國(guó)化學(xué)協(xié)會(huì)雜志(1963)85，pp.2149-2154)是將第一個(gè)氨基酸通過(guò)其酸官能團(tuán)連接至聚合物固體載體(樹(shù)脂)上，以及從該第一個(gè)氨基酸延伸肽序列，合成中的肽保持錨定在樹(shù)脂上。
對(duì)于肽No.2的合成，作為合成儀，使用了合成儀“9050 Plus PepSynthesizer”，并且用樹(shù)脂F(xiàn)moc Thr(OtBu)PEG PS作為樹(shù)脂。
合成的各步驟總結(jié)在下面表1中
表I
在合成的最后，將樹(shù)脂用二甲基甲酰胺洗滌并接著用二氯甲烷洗滌并真空干燥。
接著，將樹(shù)脂用K試劑(82％三氟乙酸；5％苯酚；5％水；5％苯甲硫醚，3％乙二硫醇)處理。通過(guò)用乙醚沉淀分離肽No.2(3B)，接著用相同溶劑漂洗。由此獲得140mg肽No.2(3B)。
然后將肽No.2(3B)通過(guò)反相液相色譜純化。使用Bondapak C-18柱作為固定相。在兩種緩沖溶液之間形成線性梯度來(lái)洗脫該肽，第一種基本為水溶液(例如水-0.1％TFA)，第二種近于有機(jī)溶液(例如含60％乙腈、39.92％水和0.08％TFA的混合物)。合并所收集的純級(jí)分，真空濃縮并冷凍干燥。
為了進(jìn)行環(huán)化，將如此得到的純化肽溶解在乙酸銨溶液(10mM)中。加入1M氫氧化銨調(diào)pH至8.5。劇烈攪拌該溶液，18小時(shí)后完成了環(huán)化。然后加入乙酸將pH降至6。將環(huán)化的肽凍干，然后如上所述通過(guò)反相液相色譜純化。
本發(fā)明化合物的制備肽No.15(22B)如肽No.2(3B)那樣合成了該肽，但使用樹(shù)脂F(xiàn)mocPAL PEG-PS。
合成的各個(gè)步驟總結(jié)在下表II中
表II
<p>在合成的最后，用二甲基甲酰胺，然后用二氯甲烷洗滌樹(shù)脂，并真空干燥。
隨后，用K試劑(82％三氟乙酸、5％苯酚、5％水、5％苯甲硫醚、3％乙二硫醇)處理該樹(shù)脂。用乙醚沉淀分離后，肽No.7(22B)用相同溶劑漂洗。這樣得到140mg肽No.15(22B)。
接著通過(guò)反向液相色譜純化肽No.15(22B)，接著如上對(duì)于肽No.2(3B)所述進(jìn)行環(huán)化、冷凍干燥并純化。
以相同方式，并且使用適宜的樹(shù)脂和氨基酸合成了其他的本發(fā)明化合物。
表III表示通過(guò)質(zhì)譜測(cè)定的非環(huán)化形式的一些式(I)肽的分子量。
表III
實(shí)施例2通過(guò)免疫酶試驗(yàn)對(duì)本發(fā)明肽的免疫反應(yīng)性的評(píng)價(jià)試驗(yàn)No.1
使用的ESS、DUR、VAU和HAD血清為來(lái)自被O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的法國(guó)病人的血清。其它被O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染病人的血清樣品通過(guò)卡麥隆的YaoundéPasteur中心獲得并根據(jù)“愛(ài)滋病雜志(AIDS)”(1977)，11，pp.445-453中描述的血清學(xué)方法血清分型為O組。
從健康的自愿者中獲得HIV-陰性血清(n＝48)將使用的合成肽以1mg/ml的濃度溶解在水中(貯液)。為了固相敏化步驟(包被)，將110μl的2μg/ml各種肽(通過(guò)將貯液用0.1M碳酸鹽緩沖液稀釋獲得)加入至微量滴定平板MicrotiterTM(NUNC)的各孔中。在室溫下保溫過(guò)夜后，首先將微量平板用包含0.1％Tween20和0.001％硫柳汞鈉的Tris-NaCl緩沖液溶液(pH7.4)洗滌，接著用包含0.5％RegilaitTM(干脫脂奶粉)的PBS溶液飽和。在抽出飽和溶液后，50℃下將平板加熱10分鐘。
將血清樣品用脫脂奶粉溶液(補(bǔ)充有0.01％苯酚紅，0.25％氯仿和0.25％Kathon的檸檬酸緩沖液中)以1/5進(jìn)行稀釋，沉積在平板的各孔中并在40℃下保溫30分鐘。
在用包含0.1％Tween20和0.001％硫柳汞鈉的Tris-NaCl緩沖液溶液(pH7.4)洗滌后，將100μl由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG和IgM山羊抗體偶聯(lián)物的包含0.01％硫柳汞鈉作為保存劑的檸檬酸緩沖液溶液加入至各孔中，接著在40℃下將平板保溫30分鐘，其中該檸檬酸緩沖液中補(bǔ)充有30％甘油和25％正常胎牛血清。
在用包含0.1％Tween20和0.001％硫柳汞鈉的Tris-NaCl緩沖液溶液(pH7.4)洗滌后，通過(guò)向各孔中加入100μl鄰苯二胺的過(guò)氧化氫溶液顯色。接著將微量平板在室溫以及黑暗中保溫30分鐘。通過(guò)加入100μl 4N硫酸終止產(chǎn)色反應(yīng)。在490nm和620nm測(cè)定吸光率(A)。
各孔中讀取的相對(duì)吸光率(A490-A620)與各肽的免疫反應(yīng)性成正比。它表明各肽與進(jìn)行試驗(yàn)的生物樣品反應(yīng)的能力。閾值被確定為等于0.15的吸光度。它相當(dāng)于陰性值的平均值(n＝48)加上12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
將本發(fā)明肽(肽No.3(4B)，肽No.2(3B)和肽No.1(2B)，均為環(huán)化形式)的反應(yīng)性與具有VAU分離物(O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒)的被膜(env)天然序列一部分并包含gp 41的免疫顯性表位的兩種合成肽的反應(yīng)性進(jìn)行了比較。
這兩種肽具有下面的序列VAU 22 AALeu Leu Asn Leu Trp Gly Cys Lys Asn Arg Ala Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn1 5 10 15 20Lys Thr22VAU 35 AAArg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe Ile Glu Glu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys1 5 10 15 20Lys Asn Arg Ala Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Lys Thr25 30 35為了該研究，使用環(huán)化形式的這些肽。研究結(jié)果示于表IV中。
表IV
血清型/基因型**＞表示信號(hào)大于分光光度計(jì)的讀程。
表IV(續(xù)
>*血清型/基固型**＞表示信號(hào)大于分光光度計(jì)的讀程。***未測(cè)表IV結(jié)果表明根據(jù)對(duì)其它肽的觀察，肽No.3(4B)顯示最好的性能。與具有對(duì)應(yīng)于gp41的免疫顯性表位的VAU分離物部分序列的兩種肽比較，該肽使得能最好地辨別被O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的病人血清。而且，本發(fā)明的肽No.2(3B)和No.1(2B)比包含相同數(shù)目氨基酸的VAU 22 AA肽免疫反應(yīng)性高。實(shí)施例3通過(guò)免疫酶試驗(yàn)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的肽的免疫反應(yīng)性的評(píng)價(jià)試驗(yàn)No.2來(lái)自O(shè)組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染病人的血清樣品通過(guò)卡麥隆的Yaounde Pasteur中心獲得，并根據(jù)“愛(ài)滋病”(1977)，11，pp.445-453中描述的血清學(xué)方法被血清分型為O組。從美國(guó)獲得基因分型的樣品(Maryland)。為了對(duì)于不同的免疫反應(yīng)性試驗(yàn)具有足夠體積，事先將這些樣品以表V給出的稀釋度稀釋在陰性人血清中。
將使用的合成肽以1mg/ml的濃度溶解在水中(貯液)。對(duì)于固相敏化步驟(包被)，如對(duì)實(shí)施例2所描述的進(jìn)行該過(guò)程。
將血清樣品用脫脂奶粉溶液(補(bǔ)充有0.01％苯酚紅，0.25％氨仿和0.25％Kathon的檸檬酸緩沖液中)以1/5進(jìn)行稀釋，沉積在平板的各孔中并在40℃下保溫30分鐘。
在用包含0.1％Tween20和0.001％硫柳汞鈉的Tris-NaCl緩沖液溶液(pH7.4)洗滌后，將100μl辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG和IgM山羊抗體偶聯(lián)物的包含0.01％硫柳汞鈉作為保存劑的檸檬酸緩沖液溶液加入至各孔中，接著在40℃下將平板保溫30分鐘，其中該檸檬酸緩沖液中補(bǔ)充有30％甘油和25％正常胎牛血清。
在用包含0.1％Tween20和0.001％硫柳汞鈉的Tris-NaCl緩沖液溶液(pH7.4)洗滌后，如實(shí)施例2所描述進(jìn)行顯色。
各孔中讀取的相對(duì)吸光度(OD)(A490-A620)與各肽的免疫反應(yīng)性成正比。它表明各肽與進(jìn)行試驗(yàn)的生物樣品反應(yīng)的能力。
將環(huán)化形式的本發(fā)明的肽肽No.10(14B)、N0.11(18B)、No.12(19B)、No.14(21B)、NO.15(22B)、No.16(23B)的反應(yīng)性與具有O組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒的被膜(env)天然序列一部分序列的三種同源合成序列比較。這些肽為來(lái)自VAU分離物的兩種肽-肽VAU22AA和肽VAU35AA-和肽MVP5180(在表V中稱為“MVP5180”)。肽VAU22AA和VAU35AA(其結(jié)構(gòu)示于實(shí)施例2中)和肽MVP5180包含gp41的免疫顯性表位。
所有這些肽以環(huán)化形式使用。MVP5180肽的序列如下MVP 5180Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly Cys1 5 10 15 20Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Thr Ser25 30 35研究結(jié)果示于表V中。
表V
<p>對(duì)于各種試驗(yàn)的肽，根據(jù)在波長(zhǎng)A492-A620處讀取的各種相對(duì)吸光度水平將樣品分成4類(a，b，c，d)·-aOD＜0.100，·-b0.100＜OD＜0.500，·-c0.500＜OD＜1.000，·-dOD＞1.000，這樣就可評(píng)價(jià)肽的免疫反應(yīng)性的程度。免疫反應(yīng)性最大的肽為在對(duì)應(yīng)于最高吸光度值的類型中發(fā)現(xiàn)的最高樣品數(shù)的那些。
結(jié)果示于表VI中。
表VI<
>固相*2μg/ml肽結(jié)果表明試驗(yàn)的本發(fā)明所有肽比來(lái)自天然分離物(MVP5180，VAU)的現(xiàn)有技術(shù)的參考肽在免疫反應(yīng)性上具有更好的性能。本發(fā)明的肽No.15(22B)、No.14(21B)和No.16(23B)顯示為免疫反應(yīng)性最大的。實(shí)施例4通過(guò)免疫酶試驗(yàn)對(duì)包含多個(gè)本發(fā)明肽的組合的免疫反應(yīng)性的評(píng)價(jià)對(duì)于本試驗(yàn)，根據(jù)實(shí)施例2描述的方法進(jìn)行操作，使用相同的血清。用環(huán)化的肽No.1(2B)、環(huán)化的肽No.3(4B)或包含這兩種肽(1∶1w/w)的組合物敏化所用的微量平板。向各孔沉積100μl包含2μg/ml肽No.1(2B)的溶液，或100μl包含肽No.3(4B)的溶液，或包含1μg/ml肽No.1(2B)和1μg/ml肽No.3(4B)的溶液。
本試驗(yàn)結(jié)果示于表VII。
表VII
*＞表示信號(hào)大于分光光度計(jì)的讀程。
表VII(續(xù))
*＞表示信號(hào)大于分光光度計(jì)的讀程。
表VII的結(jié)果表明當(dāng)用于診斷時(shí)，本發(fā)明的肽組合使得能檢測(cè)所有來(lái)自O(shè)組HIV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒感染病人的血清。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Pasteur Sanofi Diagnostics(B)街道3 boulevard Raymond Poincare(C)城市Marnes la Coquette(E)國(guó)家法國(guó)(F)郵編(ZIP)92430(G)電話0153774000(H)電傳0153774133(ii)發(fā)明名稱可用于檢測(cè)O組HIV-1病毒感染的生物試驗(yàn)的合成肽(iii)序列數(shù)目16(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Glu Thr20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Glu Thr20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Glu Thr20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Ser Thr20(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Ser Thr20(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO6Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Glu Thr20(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO7Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Glu Thr20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO8Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val Gln Trp Asn Glu Thr20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO9Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO10Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1510 15(2)SEQ ID NO11的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度32個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly1 5 10 15Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO14Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu1 5 10 15Val Cys Tyr Thr Ser Val20(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度28個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO15Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp1 5 10 15Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val20 25(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO.16Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15Val
權(quán)利要求
1.線性形式或通過(guò)半胱氨酸之間二硫鍵環(huán)化的具有13-33個(gè)氨基酸的單體類型或具有26-66個(gè)氨基酸的二聚體類型的合成肽，其對(duì)應(yīng)于通式(I)；Δ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ω(I)其中-Δ代表生物素殘基、生物胞素殘基、氫原子、乙?；?CH3CO-)、可含一個(gè)或兩個(gè)巰基、醛或胺官能基團(tuán)的脂族鏈，該脂族鏈優(yōu)選為1至6個(gè)碳原子的烷基鏈或2至6個(gè)碳原子的鏈烯基鏈，或2至6個(gè)碳原子的氨基烷基羰基鏈，-Z代表式(II)-(X)之一的肽序列-Ξ1-Ser-Ξ2- (II)-Ser-Ξ2-(III)-Ξ1-Ser-(IV)-Ξ1-Gln-Ξ2-(V)-Gln-Ξ2-(VI)-Ξ1-Gln-(VII)-Ξ1-Asn-Ξ2- (VIII)-Asn-Ξ2-(IX)Ξ1-Asn-(X)其中-Ξ1代表0-9個(gè)氨基酸的肽序列，和-Ξ2代表0-5個(gè)氨基酸的肽序列，-Θ代表式(XI)的肽序列-(AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5)-(XI)其中·(AA1)代表賴氨酸或精氨酸殘基，或鳥(niǎo)氨酸殘基，·(AA2)代表甘氨酸殘基或天冬酰胺殘基，·(AA3)代表賴氨酸或精氨酸殘基，或鳥(niǎo)氨酸殘基，·(AA4)代表亮氨酸殘基，或丙氨酸殘基或異亮氨酸殘基或谷氨酰胺殘基，·(AA5)代表異亮氨酸殘基，或纈氨酸殘基或亮氨酸殘基或蘇氨酸殘基，或正亮氨酸殘基或正纈氨酸殘基，前提是(AA1)(AA2)(AA3)(AA4)和(AA5)不一起形成肽序列-LysGlyLysLeuIle和-LysGlyLysLeuVal-，與絲氨酸的-CO-基團(tuán)相連的Ω代表-羥基(-OH)基團(tuán)或氨基(-NH2)基團(tuán)，-包含1-6碳原子的烷氧基基團(tuán)，-式(XII)的肽序列-Val-Σ-Ψ(XII)其中Σ代表式(XIII)或式(XIV)序列-(AA6)-Trp Asn-(AA7)-(AA8)(XIII)-(AA6)-Trp His-(AA7)-(AA8)(XIV)其中·(AA6)代表不同于賴氨酸的氨基酸，·(AA7)代表一個(gè)氨基酸，·(AA8)代表絲氨酸或蘇氨酸殘基，與游離AA8氨基酸的-CO-殘基相連的Ψ代表OH或NH2基團(tuán)或包含1-6個(gè)碳原子的烷氧基基團(tuán)，-式(XV)的肽序列-Val-Ψ(XV)其中與纈氨酸-CO-殘基相連的Ψ具有如式(XII)中相同的含義，-或式(XVI)-(XVIII)之一的肽序列-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ψ(XVI)Val-Σ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ(XVII)Val-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Ψ(XVIII)其中Z和Θ具有式(I)給定的定義，Σ具有式(XII)給定的定義，與絲氨酸的-CO-殘基、AA8氨基酸的-CO-殘基或纈氨酸的-CO-殘基相連的Ψ具有如式(XII)中相同的含義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的式(I)合成肽，其中(AA5)代表纈氨酸殘基，或亮氨酸殘基或蘇氨酸殘基，并且當(dāng)Ω對(duì)應(yīng)于式(XII)或(XIV)的肽序列時(shí)，(AA6)代表谷氨酰胺或精氨酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的式(I)合成肽，其中-Δ代表生物素殘基、氫原子、可包含一個(gè)或兩個(gè)巰基、醛或胺官能基團(tuán)的脂族鏈，該脂族鏈優(yōu)選為1至6個(gè)碳原子的烷基鏈，或2至6個(gè)碳原子的氨基烷基羰基鏈，-Z代表式(II)或(V)的肽序列—其中Ξ1代表兩個(gè)氨基酸的肽序列和Ξ2代表一個(gè)氨基酸，或式(IV)的序列—其中Ξ1代表三個(gè)氨基酸，或式(VIII)的肽序列—其中Ξ1代表九個(gè)、八個(gè)或三個(gè)氨基酸的肽序列和Ξ2代表五個(gè)氨基酸的肽序列，-Θ代表下式的肽序列-Lys Gly Arg Leu Val-，-Arg Gly Lys Ala Val-，-Arg Gly Arg Leu Val-，或和 -Arg Gly Arg Ala Val-，-Ω代表羥基、肽序列(XV)或?qū)?yīng)于式(XII)的肽序列的下列序列之一-Val Arg Trp Asn Glu Thr-Ψ，-Val Gln Trp Asn Glu Thr-Ψ或-Val Gln Trp Asn Ser Thr-Ψ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的式(I)合成肽，其中Z代表下式的肽序列· -Leu Leu Ser Ser-· -Leu Leu Asn Ser-· -Arg Leu Asn Ser-· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-· -Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-或· -Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的具有20-50個(gè)氨基酸的合成肽其具有式(Ia)A-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ωa(Ia)其中Za代表式IIa-Xa的基團(tuán)Ξ1a-Ser-Ξ2a(IIa)-Ser-Ξ2a(IIIa)-Ξ1a-Ser (IVa)Ξ1a-Gln-Ξ2a(Va)-Gln-Ξ2a(VIa)Ξ1a-Gln- (VIIa)Ξ1a-Asn-Ξ2a(VIIIa)-Asn-Ξ2a(IXa)-Ξ1a-Asn (Xa)其中-Ξ1a代表1-5個(gè)氨基酸的肽序列，和-Ξ2a為一個(gè)氨基酸，-Ωa如式(I)所定義代表式(XII)的肽序列，或式(XVIIa)的肽序列Val-Σ-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ(XVIIIa)及Δ、Θ、Σ和Ψ具有如式(I)中相同的含義。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的式(I)的合成肽，包含下面序列中的一種序列No.1-LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22序列No.2-LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn15 10 15 20Glu Thr-22序列No.3-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr-22序列No.4-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn15 10 15 20Ser Thr-22序列No.5-LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST-或-Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu alV Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn15 10 15 20Ser Thr-22序列No.6-LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn15 10 15 20Glu Thr-22序列No.7-LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn15 10 15 20Glu Thr-22序列No.8-LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn15 10 15 20Glu Thr-22序列No.9-LLSSWGCKGRLVCYTS-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser-15 10 15序列No.10-LLNSWGCKGRLVCYTS-或-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser-15 10 15序列No.11-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30序列No.12-ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30序列No.13-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30序列No.14-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr1 5 10 15Thr Ser Val-20序列No.15-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys1 5 10 15Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-20 25序列No.16-RLNSWGCKGRLVCYTSV-or-Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-15 10 15
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的合成肽，其具有下列序列肽No.1(2B)LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.2(3B)LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.3(4B)LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.4(5B)LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Ser Thr22肽No.5(6B)LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST或Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Ser Thr22肽No.6LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET或Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.7LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.8(7B)LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn1 5 10 15 20Glu Thr22肽No.9(12B)LLSSWGCKGRLVCYTS或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15肽No.10(14B)LLNSWGCKGRLVCYTS或Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser1 5 10 15肽No.11(18B)ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET或Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly15 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30肽NO.12(19B)ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET或Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30肽No.13(20 B)ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30肽No.14(21B)LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV或Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr1 5 10 15Thr Ser Val20肽No.15(22B)RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV或Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys1 5 10 15Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val20 25肽No.16(23B)RLNSWGCKGRLVCYTSV或Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys TyrThr Ser Val
8.包含一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的式(I)合成肽的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的組合物，其包含肽No.3(4B)和肽No.1(2B)。
10.包含一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1的式(I)合成肽和一種或多種O組HIV-1重組肽的組合物。
11.包含一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1的式(I)合成肽和一種或多種HIV-1和/或HIV-2的重組或合成肽的組合物。
12.使用一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的式(I)合成肽的免疫分析方法。
13.使用根據(jù)權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的組合物的免疫分析方法。
14.一種診斷試劑盒，其包括至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的式(I)合成肽或根據(jù)權(quán)利要求8-11任一項(xiàng)的組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及在檢測(cè)O組HIV－1病毒感染的生物試驗(yàn)中使用的合成肽,制備它們的方法,包含這些肽的組合物和試劑盒以及使用這些肽的生物試驗(yàn)。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1256695SQ9880520
公開(kāi)日2000年6月14日 申請(qǐng)日期1998年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月9日
發(fā)明者D·M·B·徹耐?？怂? J－F·H·戴拉格尼尤, S·J·X·加戴爾, F·Y·瑞尤尼爾 申請(qǐng)人:巴斯德·賽諾菲診斷劑公司