專(zhuān)利名稱(chēng)：監(jiān)視細(xì)菌腫瘤治療的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌作為進(jìn)行腫瘤治療的載體的用途和監(jiān)測(cè)定位(localization)及功效(efficacy)的方法。更詳細(xì)地，本發(fā)明涉及在細(xì)菌中傳遞的熒光蛋白監(jiān)測(cè)抗腫瘤藥物的傳遞(delivery)和功效(efficacy)的用途。
背景技術(shù)：
到如今已很好地確定了綠色熒光蛋白在使癌進(jìn)展(progression)和轉(zhuǎn)移(metastasis)可見(jiàn)中的用途。例如見(jiàn)Hoffman，R.M.，Methods in Enzymology(1999)30220-31(P.Michael Conn，ed.，Academic Press，San Diego)。在美國(guó)專(zhuān)利6,251,384中公開(kāi)了用全身成像(whole body imaging)來(lái)對(duì)實(shí)時(shí)(real time)進(jìn)展(progression)制圖并評(píng)估治療腫瘤的建議方案的功效，其內(nèi)容被引入本發(fā)明中作為參考。
包括在綠色熒光蛋白的優(yōu)點(diǎn)中的特征是其不需要任何底物或輔助因子來(lái)發(fā)熒光且其在活細(xì)胞中的表達(dá)不引起任何明顯的生物損傷。此外，熒光發(fā)光的水平使得其成為特別靈敏的技術(shù)。除了直接的目視觀察，利用簡(jiǎn)單的設(shè)備能得到全身影像，例如來(lái)自氙或汞燈的490nm激發(fā)(excitation)連同通過(guò)CCD彩色攝像機(jī)捕獲影像。這些允許了實(shí)時(shí)研究腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。例如，見(jiàn)Yang，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)971206-1211。
美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/304,223，2001年7月9日申請(qǐng)，其內(nèi)容被引入本文中作為參考，描述了利用熒光蛋白標(biāo)記大腸桿菌和其它細(xì)菌以監(jiān)視感染和評(píng)價(jià)其治療。該項(xiàng)技術(shù)描述的以良性方式標(biāo)記細(xì)菌的能力使其能適合最近描述的用于腫瘤治療的組合溶菌(bacteriolytic)療法的方案。該標(biāo)記細(xì)菌的技術(shù)在Zhao，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)989814-9818和Yang，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)9712278-12282中也有描述，將所述申請(qǐng)引入本發(fā)明中作為參考。
利用熒光蛋白標(biāo)記細(xì)菌和它們的產(chǎn)品的能力對(duì)新開(kāi)發(fā)的治療實(shí)體瘤(solid tumors)的方法提供了顯著的改進(jìn)，所述治療實(shí)體瘤的方法由Dang，L.H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)9815155-15160中描述。腫瘤治療的該途徑，由其開(kāi)發(fā)者命名為“組合溶菌療法”或“COBALT”，利用了特定厭氧菌在實(shí)體瘤內(nèi)部缺氧環(huán)境中優(yōu)先生長(zhǎng)的性質(zhì)。該文章調(diào)查了大量雙歧桿菌屬(Bifidobacteria)、乳酸菌(Lactobacilli)和梭狀芽孢桿菌(Clostridia)的生長(zhǎng)性質(zhì)，所有這些在腫瘤的含氧量低(hypoxic)的區(qū)域中選擇性地增殖，并引用了大量的論文確立此事實(shí)。細(xì)菌它們自己可以在瘤內(nèi)被注入，但是為了提供更方便的給予方式，作者利用了也在現(xiàn)有技術(shù)中確立的事實(shí)，即雖然當(dāng)靜脈內(nèi)注入時(shí)活細(xì)菌是直接有毒的，這些細(xì)菌的芽孢能夠通過(guò)靜脈內(nèi)注入正常小鼠中而不會(huì)引起直接的副作用。這并不完全正確；除非細(xì)菌分泌毒素的能力被削弱，靜脈內(nèi)給予所述芽孢是非常致命的。作者利用單個(gè)毒素基因位于噬菌體游離基因(phage episome)內(nèi)，從而熱處理的細(xì)菌顯示出噬菌體喪失的事實(shí)，成功使諾氏梭狀芽胞桿菌(Clostridium novyi)喪失這種能力。因此開(kāi)發(fā)了一種菌株，當(dāng)靜脈內(nèi)給予芽孢時(shí)，該菌株是無(wú)毒的。
遇到的另一個(gè)問(wèn)題是許多厭氧菌株在含氧量低的腫瘤背景中聚集(cluster)成少量菌落的傾向。已發(fā)現(xiàn)諾氏梭菌(Clostridium novyi)和索狀梭菌(C.sordellii)在含氧量低的腫瘤區(qū)域中能夠以分散方式生長(zhǎng)。因此，通過(guò)創(chuàng)建諾氏梭菌(C.novyi)(C.novyi-NT)Dang等的無(wú)毒模型(version)，能夠靜脈內(nèi)引入芽孢來(lái)指向(home to)腫瘤并且因?yàn)樗鼈冊(cè)趬乃绤^(qū)域內(nèi)獨(dú)特生長(zhǎng)，能夠毀壞周?chē)拇婊畹哪[瘤細(xì)胞。這些細(xì)菌到達(dá)含氧量低、壞死的區(qū)域(發(fā)現(xiàn)其占＞1cm3的活組織檢查的樣本中25％-75％的腫瘤體積)的能力是決定性的。壞死區(qū)域(由于缺乏氧其是壞死的)通常被存活細(xì)胞所包圍。化學(xué)治療劑不能到達(dá)這些細(xì)胞，因?yàn)槟抢餂](méi)有輸送它們的循環(huán)血，并且對(duì)放射相對(duì)免疫，因?yàn)榉派湫枰鮼?lái)發(fā)揮致命性影響。因此，厭氧菌在含氧量低的腫瘤環(huán)境中生長(zhǎng)旺盛的能力使得它們成為用于治療的有價(jià)值的輸送系統(tǒng)。所述細(xì)菌本身的生長(zhǎng)確實(shí)能引起腫瘤退化，這由Dang等證明。也見(jiàn)Yazawa，K.等，Cancer Gene Therapy(2000)17269-274；Yazawa，K.等，Breast Cancer Res.&Dev.(2001)666665-170。
Low，K.B.等，Nature Biotechnology(1999)1737-41更早地描述了相似的方法。在這種情況中，將沙門(mén)氏菌(Salmonella)菌株作為抗腫瘤劑開(kāi)發(fā)，因?yàn)樗鼈兡茉谌毖醯沫h(huán)境中生存，并且優(yōu)先在腫瘤的含氧量低的區(qū)域中增殖。也修飾(modified)它們來(lái)生產(chǎn)在腫瘤治療中有用的蛋白，例如所述前藥轉(zhuǎn)化酶胸苷激酶(thymidine kinase)，Pawelek，J.等，Cancer Res.(1997)574537-4544。然而，因脂質(zhì)A刺激由腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)發(fā)生的膿毒癥(sepsis)有效地阻止了在腫瘤治療中沙門(mén)氏菌的用途。Low等能夠分裂(disrupt)沙門(mén)氏菌中的msb基因以減少TNFα誘導(dǎo)，以便廢除該細(xì)菌誘導(dǎo)膿毒癥的能力卻保持其抗腫瘤活性。這些作者顯示了給予患黑瘤素的小鼠修飾的細(xì)菌18天后腫瘤的尺寸小于未治療對(duì)照組中腫瘤尺寸的8％。
因此，本領(lǐng)域已證明包括兼性厭氧菌的厭氧菌能選擇性地進(jìn)入腫瘤的含氧量低的區(qū)域，并且缺乏通常與它們相關(guān)的毒性作用的這種細(xì)菌的修飾類(lèi)型能安全用于治療。
用于獲得熒光蛋白合適表達(dá)的物質(zhì)和方法是容易可得的。包含不同的GFP修飾形式以提供不同顏色的載體由Clontech銷(xiāo)售。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的Clontech載體使所述GFP處于細(xì)胞巨化病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制之下；這種表達(dá)系統(tǒng)也可用來(lái)標(biāo)記病毒感染劑(viral infectious agents)。GFP表達(dá)細(xì)菌先前已用于許多的研究，然而沒(méi)有用于整體(intact)的活動(dòng)物(Wu，H.等，Microbiol.(2000)1462481-2493；Ling，S.H.M.等，Microbiol.(2000)1467-19；Badger，J.L.等，Mol.Microbiol.(2000)36(1)174-182；Kohler，R.等，Mol.Gen.Genet.(2000)2621060-1069；Valdivia，R.H.等，Gene(1996)17347-52；Valdivia，R.H.等，Science(1997)2772007-2011；Scott，K.P.等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Ltrs.(2000)18223-27；Prachaiyo，P.等，J.Food Protect.(2000)63427-433；Geoffroy，M-C.，Applied & Env.Microbiol.(2000)66383-391))。這種研究的一個(gè)例子是通過(guò)致病的大腸桿菌O157H GFP使肌肉組織的體外感染可見(jiàn)(Prachaiyo，P.等，見(jiàn)上文)。另一個(gè)方法是通過(guò)摘除并固定胃腸道組織檢驗(yàn)管飼法(gavage)感染后小鼠胃腸道(Geoffroy，M-C.，見(jiàn)上文)。在摘除它們的器官后，制作感染了GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的遲鈍愛(ài)德華菌(Edwardsiella tarda)的魚(yú)的感染影像(Ling，S.H.M.等，見(jiàn)上文)。通過(guò)與GFP表達(dá)連接來(lái)評(píng)價(jià)與毒性(virulence)和其他感染過(guò)程相關(guān)的基因(Ling，S.H.M.等，見(jiàn)上文；Badger，J.L.等，見(jiàn)上文；Kohler，R.等，見(jiàn)上文；Valdivia，R.H.等，見(jiàn)上文(1996))。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種方法來(lái)監(jiān)視能夠在含氧量低的腫瘤區(qū)域中生長(zhǎng)的細(xì)菌的靶向(targeting)和增殖并評(píng)價(jià)由這些細(xì)菌提供的抗腫瘤活性的成功產(chǎn)生。同時(shí)，治療的功效可以通過(guò)標(biāo)記和觀察腫瘤細(xì)胞自身來(lái)評(píng)價(jià)。因此，本發(fā)明提供方法來(lái)監(jiān)視，并且如果必須的話，修飾(modify)通過(guò)這些細(xì)菌介導(dǎo)的腫瘤治療。
因此，一方面，本發(fā)明涉及證實(shí)細(xì)菌增殖分布的方法，此增殖限制于并分布在含氧量低的腫瘤體積內(nèi)，該方法包括在活對(duì)象體內(nèi)非侵入性地(noninvasively)檢測(cè)包含在給予所述對(duì)象的細(xì)菌內(nèi)的熒光蛋白所發(fā)射的熒光。
另一方面，本發(fā)明涉及監(jiān)視由細(xì)菌產(chǎn)生的抗腫瘤藥物產(chǎn)生的方法，所述產(chǎn)生定位于對(duì)象體內(nèi)的腫瘤的含氧量低的體積中，通過(guò)在活對(duì)象體內(nèi)非侵入性地監(jiān)測(cè)給予對(duì)象的細(xì)菌所產(chǎn)生的與治療劑融合的蛋白的熒光而進(jìn)行。
第三方面，本發(fā)明的方法涉及監(jiān)測(cè)利用細(xì)菌作為治療劑和/或用輸送系統(tǒng)將治療劑傳遞至實(shí)體瘤的含氧量低的體積的腫瘤治療的有效性，該方法包括通過(guò)評(píng)價(jià)用熒光蛋白標(biāo)記的腫瘤發(fā)射出的熒光來(lái)檢測(cè)腫瘤增殖或無(wú)增殖和其轉(zhuǎn)移。通過(guò)使用不同波長(zhǎng)的熒光發(fā)射，可與如前所述的監(jiān)視治療途徑相結(jié)合而進(jìn)行該方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于監(jiān)視實(shí)體瘤的含氧量低部分的細(xì)菌感染的進(jìn)展的系統(tǒng)。該細(xì)菌應(yīng)當(dāng)是那些可以在這些腫瘤中缺氧的或基本上缺氧的含氧量低的區(qū)域中存活的那些。因此，所述細(xì)菌必須是兼性的(facultative)或?qū)Ｐ缘?obligate)厭氧菌。兼性厭氧菌例如大腸桿菌是優(yōu)選的，因?yàn)榕c大部分專(zhuān)性厭氧菌相比它們對(duì)與它們接觸的對(duì)象的毒性較低。利用可見(jiàn)的標(biāo)記熒光蛋白來(lái)標(biāo)記細(xì)菌，以便能夠跟蹤實(shí)體瘤中它們的遷移和定居(colonization)，從而能夠控制和評(píng)價(jià)由這些細(xì)菌的治療劑的定位產(chǎn)生。
因?yàn)橥ㄟ^(guò)利用熒光蛋白來(lái)觀察熒光細(xì)胞的遷移和完整(intact)動(dòng)物中蛋白的產(chǎn)生能夠獲得足夠的強(qiáng)度，除了測(cè)定這些方面外，在完整對(duì)象中可以觀察腫瘤退化和轉(zhuǎn)移或其抑制的進(jìn)展，因?yàn)樗瞿[瘤細(xì)胞自身能用在不同波長(zhǎng)下發(fā)熒光的蛋白來(lái)標(biāo)記。
在本發(fā)明的各方面中使用的標(biāo)記是熒光蛋白，即當(dāng)用合適的波長(zhǎng)照射時(shí)發(fā)出可見(jiàn)光的蛋白。編碼這一綱(class)中的原始(seminal)蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)的自然基因(native gene)克隆自生物發(fā)光水母維多利亞多管水母(Aequorea victoria)(Morin，J.等，J.Cell Physiol(1972)77313-318)?；蚩傻眯?availability)使利用GFP作為基因表達(dá)的標(biāo)記物成為可能。原始GFP自身是283氨基酸蛋白，分子量為27kD。為了發(fā)熒光，它不需要來(lái)自其天然來(lái)源的另外的蛋白，也不需要只在其天然來(lái)源中存在的底物或輔助因子。(Prasher，D.C.等，Gene(1992)111229-233；Yang，F(xiàn).等，Nature Biotechnol(1996)141252-1256；Cody，C.W.等，Biochemistry(1993)321212-1218)。已發(fā)現(xiàn)原始GFP基因的突變能用來(lái)增強(qiáng)表達(dá)并改進(jìn)產(chǎn)品的激發(fā)及熒光，這樣已經(jīng)獲得了各種顏色的“GFP”，包括紅色、黃色和藍(lán)色。GFP-S65T(其中在65位的絲氨酸被蘇氨酸代替)在本發(fā)明的方法中是尤其有用的，并且在490nm有單個(gè)的激發(fā)峰。(Heim，R.等，Nature(1995)373663-664)；美國(guó)專(zhuān)利5,625,048。Delagrade，S.等，Biotechnology(1995)13151-154；Cormack，B.等，Gene(1996)17333-38和Cramer，A.等，Nature Biotechnol(1996)14315-319也公開(kāi)了其它突變體。在美國(guó)專(zhuān)利5,625,048中也公開(kāi)了另外的突變體。
通過(guò)合適的修改，可以改變所述GFP發(fā)出的光的光譜。因此，雖然由于歷史習(xí)慣在本申請(qǐng)中經(jīng)常使用術(shù)語(yǔ)“GFP”，但是在此定義中包括的蛋白不是必須以綠色出現(xiàn)，且應(yīng)該簡(jiǎn)單地指熒光蛋白。不同形式的“GFP”呈現(xiàn)綠色之外的顏色，這些也被包括在“GFP”的使用中，并且在本發(fā)明的方法和材料中有用。另外，發(fā)現(xiàn)落在本文“GFP”的定義內(nèi)的綠色熒光蛋白，已從其它生物(organism)分離，例如腎海鰓(sea pansy)、腎海鰓(Renillareniformis)。可用任何顏色的“GFP”的任何合適和方便形式來(lái)修飾天然的和突變體形式的在本發(fā)明中有用的感染劑。
為了避免混淆，也經(jīng)常使用簡(jiǎn)單術(shù)語(yǔ)“熒光蛋白”；通常，其被理解為指由各種生物體產(chǎn)生的熒光蛋白，例如腎海鰓(Renilla)和多管水母(Aequorea)以及這些天然熒光蛋白的修飾形式，它們?cè)诓煌目梢?jiàn)顏色下可以發(fā)熒光。通常，術(shù)語(yǔ)“熒光蛋白”和“GFP”有時(shí)可交換地使用；然而，有時(shí)可以發(fā)現(xiàn)特定的其它顏色。該系統(tǒng)是嚴(yán)格記憶的，從而例如，RFP指紅色熒光蛋白、YFP指黃色熒光蛋白、BFP指藍(lán)色熒光蛋白等。這些蛋白發(fā)射的可見(jiàn)光的波長(zhǎng)范圍取決于所作的特定修飾。
因?yàn)榇嬖诙喾N顏色的熒光蛋白，可同時(shí)做出多于單一顏色的成像。例如，可以給予所述對(duì)象兩種不同的細(xì)菌劑或三種不同的細(xì)菌，每一個(gè)表達(dá)特性熒光，或者單一細(xì)菌可以被單一顏色和用于與基因產(chǎn)品產(chǎn)生融合的不同顏色組合(constitutively)標(biāo)記?？蓪⒕幋a與用來(lái)標(biāo)記細(xì)菌本身顏色不同的熒光蛋白的核苷酸序列插入將要被生產(chǎn)的蛋白的基因位點(diǎn)或與要生產(chǎn)的治療蛋白作為載體中的融合蛋白。
在本發(fā)明的上下文中顏色的多樣性是尤其有利的。例如，腫瘤自身可以用一種顏色的熒光蛋白標(biāo)記，給予的細(xì)菌用具有不同顏色的結(jié)構(gòu)或細(xì)胞內(nèi)蛋白標(biāo)記，從而可以確定所述細(xì)菌的定位，并且細(xì)菌的蛋白產(chǎn)品用第三種顏色標(biāo)記，這樣可以監(jiān)視這種蛋白產(chǎn)生的水平。因此，利用活動(dòng)物的全身觀察，可以測(cè)定給予的細(xì)菌的定位，同時(shí)監(jiān)視該細(xì)菌產(chǎn)生的治療蛋白的水平并監(jiān)視對(duì)腫瘤的作用，所有這些同時(shí)進(jìn)行。
在本發(fā)明中使用的熒光蛋白有足夠的強(qiáng)度，可以進(jìn)行對(duì)活動(dòng)物的上述現(xiàn)象的實(shí)時(shí)觀察。這比在現(xiàn)有技術(shù)中描述的細(xì)菌傳送的“盲”途徑(“blind”approach)有較大的進(jìn)步。因?yàn)樵搫?dòng)物是活的，當(dāng)由這些觀察指示時(shí)，可以有利改進(jìn)治療方案來(lái)增強(qiáng)其功效。
受益于本發(fā)明方法的動(dòng)物對(duì)象(animal subjects)是一系列受實(shí)體瘤影響的動(dòng)物，但典型地是脊椎動(dòng)物，例如魚(yú)、鳥(niǎo)和哺乳動(dòng)物，最典型是哺乳動(dòng)物。對(duì)人類(lèi)的治療是尤其關(guān)注的，但是對(duì)家畜的治療，例如豬、母牛、綿羊、山羊和小雞、火雞等，如同伴侶(companion)動(dòng)物例如狗和貓的治療一樣顯然也是有益的。由于所使用的熒光蛋白所發(fā)射的熒光強(qiáng)度，本發(fā)明的方法提供對(duì)任何這些動(dòng)物對(duì)象提供無(wú)侵入性技術(shù)的實(shí)時(shí)觀察。
如果想對(duì)腫瘤進(jìn)行標(biāo)記，在美國(guó)專(zhuān)利6251384和6235968中本申請(qǐng)人已經(jīng)描述了所述腫瘤細(xì)胞中熒光蛋白的產(chǎn)生，它們都在這里被引入作為參考。簡(jiǎn)要地，可以將用于熒光蛋白表達(dá)的病毒載體，優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，給予已經(jīng)患了實(shí)體瘤的對(duì)象。或者，就實(shí)體瘤來(lái)說(shuō)，表達(dá)載體可以被瘤內(nèi)注射。通過(guò)向無(wú)免疫應(yīng)答的(immunocompromised)或同源動(dòng)物(syngeneicanimal)中植入腫瘤來(lái)得到模型系統(tǒng)，所述腫瘤由被修飾而含有用于熒光蛋白表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞產(chǎn)生。描述了多種方法，它們導(dǎo)致腫瘤自身的標(biāo)記。
關(guān)于標(biāo)記細(xì)菌，可以通過(guò)直接修飾來(lái)將編碼熒光蛋白的核苷酸序列引入細(xì)菌中，直接修飾例如修飾基因組從而將熒光蛋白編碼序列定位在與細(xì)菌內(nèi)源的控制序列下的合適位置，或可以利用合適的表達(dá)載體將其引入。選擇的細(xì)菌在實(shí)體瘤的含氧量低的區(qū)域中優(yōu)選選擇性地存活和增殖，如果不是完全特異性地的話，留下宿主動(dòng)物的剩余部分優(yōu)選基本無(wú)細(xì)菌(uninhabited)，即使全身給予所述細(xì)菌也是如此。優(yōu)選地，與集中于小菌落相反，所述細(xì)菌培養(yǎng)物可以分散于含氧量低的腫瘤體積中。
通過(guò)原位直接觀察，本發(fā)明提供測(cè)定最有用的細(xì)菌宿主的直接方法。因此，通過(guò)插入基因組或通過(guò)提供表達(dá)載體來(lái)標(biāo)記選擇的菌株并將菌株給予動(dòng)物。因此，能直接觀察腫瘤中與其它組織相比的增殖方式并且選擇具有理想方式的菌株。大量能夠在含氧量低的腫瘤體積中增殖的候選物(candidates)在本領(lǐng)域是已知的，包括大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、梭菌(Clostridium)、乳酸桿菌、雙歧桿菌等。在這些系統(tǒng)中用于表達(dá)的合適的控制序列目前在本領(lǐng)域也是已知的，或可以使用內(nèi)源控制序列。
在許多情況中，更理想的是修飾所述細(xì)菌使其失去產(chǎn)生毒性作用的任何能力。對(duì)于專(zhuān)性厭氧菌這是更常見(jiàn)的。如果所述細(xì)菌分泌毒素、可能需要缺失或失活產(chǎn)生該毒素的基因；如果所述細(xì)菌產(chǎn)生引起不希望的副作用的物質(zhì)，編碼這些物質(zhì)的基因可以被失活或移除。修飾所述細(xì)菌以作為細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的常見(jiàn)性質(zhì)在組成型啟動(dòng)子(constitutive promoter)的控制下表達(dá)熒光蛋白，或?qū)⑺鼍幋a序列置于基因組序列的特定理想位置，替代內(nèi)源序列。
除了發(fā)揮其自己固有的抗腫瘤作用，所述細(xì)菌也可以被修飾來(lái)生產(chǎn)治療劑，例如IL2或蛋氨酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療蛋白任選作為與熒光蛋白的融合蛋白產(chǎn)生。如果腫瘤和/或細(xì)菌是被標(biāo)記的，則融合中所述熒光蛋白的顏色應(yīng)該是與在其它兩種情況中選擇的顏色不同的顏色。如上所述，帶有熒光蛋白的融合物(fusions)的構(gòu)建物(construction)公知為標(biāo)記物。用于治療蛋白的表達(dá)系統(tǒng)，單獨(dú)地或是作為與熒光蛋白的融合物，可以被放置在載體上或所述細(xì)菌的基因組中，并且控制序列可以是組成型的(constitutive)或在許多情況下，是誘導(dǎo)型的(inducible)且取決于原位因子或外部提供的轉(zhuǎn)錄因子。
一種特別優(yōu)選的治療蛋白的實(shí)施例是蛋氨酸酶，如PCT公開(kāi)WO00/29589中所公開(kāi)的那樣，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)提供時(shí)蛋氨酸酶發(fā)揮抗腫瘤作用，將上述出版物引入本發(fā)明中作為參考，或如美國(guó)專(zhuān)利5690929和WO94/11535所描述，當(dāng)作為藥物提供時(shí)蛋氨酸酶發(fā)揮抗腫瘤作用，將上述文獻(xiàn)引入本發(fā)明中作為參考。在這些文獻(xiàn)中也公開(kāi)了蛋氨酸酶的重組產(chǎn)生。
除了其對(duì)腫瘤的固有作用，也可以使用作為酶的治療蛋白來(lái)從前藥中釋放毒性物質(zhì)。例如，Miki，K.等，Cancer Research(2001)616805-6810描述了利用甲基硒醇(methyl selenol)的毒性的研究。該化合物可以通過(guò)蛋氨酸酶的作用由硒代蛋氨酸(selenomethionine)產(chǎn)生。該文章描述了試驗(yàn)，其中由硒代蛋氨酸產(chǎn)生的甲基硒醇通過(guò)重組產(chǎn)生的蛋氨酸酶殺死用此酶的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞。因此，在硒代蛋氨酸的存在下，蛋氨酸酶的重組產(chǎn)生能被用作癌癥治療。
在本發(fā)明的一個(gè)僅用于說(shuō)明的實(shí)施方案中，修飾細(xì)菌例如長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum)或諾氏梭菌使它們不能產(chǎn)生任何毒素。修飾該去毒(detoxicated)的細(xì)菌以包含與熒光蛋白融合的蛋氨酸酶的表達(dá)系統(tǒng)。此外，如果需要，修飾該細(xì)菌來(lái)包含標(biāo)記細(xì)菌本身的熒光蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。如果蛋氨酸酶基因是組成型表達(dá)的，這不是必須的，因?yàn)榈鞍彼崦缸陨淼漠a(chǎn)生會(huì)發(fā)出細(xì)菌存在的信號(hào)。然后將修飾的細(xì)菌給予患有腫瘤的試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)象，例如從人類(lèi)MDA-MB-435乳腺癌細(xì)胞形成的腫瘤，其已經(jīng)用與融合蛋白所用的顏色不同的熒光標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記。或者，腫瘤是固有的(indigenous)，并用病毒表達(dá)載體來(lái)標(biāo)記，如上面引用的美國(guó)專(zhuān)利6,251,384和6,235,968中所述。
如果使用細(xì)菌細(xì)胞，則將細(xì)胞直接注射入乳腺癌腫瘤中；如果使用芽孢，也可以使用靜脈內(nèi)注射。直接腫瘤內(nèi)注射芽孢也是可能的。將合適修飾的細(xì)菌以任何實(shí)用的方式給予對(duì)象。在試驗(yàn)?zāi)[瘤模型情況下，為提供模型所述對(duì)象可能必須與腫瘤無(wú)免疫應(yīng)答或是同源的，給予所述細(xì)菌本身不需要所述對(duì)象是無(wú)免疫應(yīng)答的。因此，在對(duì)象患固有腫瘤的情況下，免疫抑制不是必須的。在有完整免疫系統(tǒng)的動(dòng)物中，在含氧量低的腫瘤中容易發(fā)生感染。然而，無(wú)免疫應(yīng)答的對(duì)象也能用于研究腫瘤被人工引入處的病況的進(jìn)展。
在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記蛋氨酸酶產(chǎn)生的標(biāo)記物發(fā)出紅色熒光(RFP)，所述細(xì)菌的特征是發(fā)出藍(lán)色熒光(BFP)且所述腫瘤的特性是發(fā)出綠色熒光(GFP)。
此外，如果需要，將硒代蛋氨酸注射入腫瘤中或全身提供。蛋氨酸酶本身的產(chǎn)生和/或細(xì)菌本身的存在對(duì)于腫瘤是有毒性的。釋放的甲基硒醇不僅對(duì)于細(xì)菌駐留的直接區(qū)域是有毒性的，而且更廣泛地?cái)U(kuò)散至活腫瘤組織。此治療的進(jìn)展可以通過(guò)同時(shí)顯影RFP、GFP和BFP直接監(jiān)視。
從外面對(duì)全身對(duì)象作熒光光學(xué)腫瘤成像(FOTI)允許對(duì)于模型系統(tǒng)或患有固有腫瘤的對(duì)象在連續(xù)基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察并監(jiān)視感染的進(jìn)展，并對(duì)所述方案進(jìn)行評(píng)估。在被治療的對(duì)象中，F(xiàn)OTI的存在使得在改進(jìn)或不改進(jìn)所述方案的合理性的連續(xù)基礎(chǔ)上對(duì)那些設(shè)計(jì)的治療方案進(jìn)行告知。模型系統(tǒng)用于治療的起始設(shè)計(jì)。除了外部(FOTI)成像，也可以使用非侵入性內(nèi)窺鏡檢查方法。
用作模型的合適的對(duì)象優(yōu)選是哺乳動(dòng)物對(duì)象，最優(yōu)選是方便的試驗(yàn)室動(dòng)物例如兔、大鼠、小鼠等。至于與人類(lèi)對(duì)象更接近的類(lèi)似物，也可以使用靈長(zhǎng)類(lèi)。可以使用任何合適的對(duì)象，主要根據(jù)方便性及與最感興趣的系統(tǒng)的相似性來(lái)選擇。
下面的實(shí)施例是為了說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。
制備A厭氧菌的修飾用從lac啟動(dòng)子表達(dá)的GFP將維多利亞多管水母(A.victoria)綠色熒光蛋白的變體克隆入pUC19衍生物pPD 16.38(Clontech，Palo Alto，CA)的BamHI和NotI位點(diǎn)。所述載體被稱(chēng)作pAV-GFP。將pAV-GFP通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法轉(zhuǎn)染入鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)感受態(tài)細(xì)胞中，并通過(guò)在瓊脂板上的氨芐青霉素抗性選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通過(guò)熒光顯微鏡選擇高表達(dá)的鼠傷寒沙門(mén)氏菌-GFP克隆。
實(shí)施例1用紅色熒光蛋白(RFP)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌，并將其注射入含有用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的腫瘤的裸小鼠。利用CCD照相機(jī)和GFP-RFP濾光器在光盒中通過(guò)藍(lán)光激發(fā)可使該動(dòng)物可見(jiàn)；通過(guò)紅色和綠色光可使所述腫瘤中的細(xì)菌生長(zhǎng)可見(jiàn)。已用前列腺癌、黑素瘤、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌、喉癌、腦癌和胰腺癌試驗(yàn)了其中腫瘤被GFP標(biāo)記的裸小鼠腫瘤模型。
實(shí)施例2利用由與GFP偶聯(lián)的蛋氨酸酶組成的融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌。將經(jīng)標(biāo)記的細(xì)菌注射入已被RFP標(biāo)記在裸小鼠中生長(zhǎng)的腫瘤。然后通過(guò)腫瘤內(nèi)注射給予小鼠硒代蛋氨酸。利用如實(shí)施例1中的兩種顏色成像來(lái)使細(xì)菌對(duì)腫瘤的靶向可見(jiàn)并追蹤所述治療效果。
實(shí)施例3將GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌注射入裸小鼠中的RFP-標(biāo)記的U-87人類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中。將含有1×108GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌的PBS溶液(10μl)注射入RFP-標(biāo)記的U-87人類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤。立即在注射后以及在注射后一天，如實(shí)施例1在RFP-標(biāo)記的U-87人類(lèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中成像GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌。在這兩種情況下，可以看見(jiàn)在RFP背景上的GFP，并且一天后其已擴(kuò)散。
實(shí)施例4將GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌注射入裸小鼠中的RFP-標(biāo)記的DU-145人類(lèi)前列腺腫瘤。在一只小鼠中，將1×108GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌注射入RFP-標(biāo)記的DU-145人類(lèi)前列腺腫瘤中，并在注射后立即成像。在第二只小鼠中，將2×108GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌注射入RFP-標(biāo)記的DU-145人類(lèi)前列腺腫瘤中，并如實(shí)施例1在注射后立即成像。在這兩種情況下，可以看見(jiàn)在RFP背景上的GFP。
實(shí)施例5將GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌注射入裸小鼠中的RFP-標(biāo)記的MDA MB-435人類(lèi)乳腺腫瘤。將含有2×108GFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌的緩沖液注射入RFP-標(biāo)記的MDA MB-435人類(lèi)乳腺腫瘤中，并如實(shí)施例1在注射后立即成像。可以看見(jiàn)在RFP背景上的GFP。
實(shí)施例6RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌能夠在裸小鼠中的GFP-標(biāo)記的PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤中生長(zhǎng)。將含有3×108RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌的緩沖液注射入GFP-標(biāo)記的PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤中，并且立即在注射后以及在注射后一天如實(shí)施例1成像。在所有成像中可以看見(jiàn)在RFP背景上的GFP，并隨時(shí)間擴(kuò)散。
實(shí)施例7在第二個(gè)試驗(yàn)中，RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌能夠在裸小鼠中的GFP-標(biāo)記的PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤中生長(zhǎng)。將含有2×108RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌的緩沖液注射入GFP-標(biāo)記的PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤中，并且立即在注射后、在注射后一天及注射后四天如實(shí)施例1成像。在所有成像中可以看見(jiàn)在RFP背景上的GFP。
實(shí)施例8通過(guò)組織學(xué)也證明了在裸小鼠中生長(zhǎng)的GFP-標(biāo)記的PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤中的RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌的靶向和逐漸地生長(zhǎng)。在注射后四天獲得了含在GFP-標(biāo)記的PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤中生長(zhǎng)的沙門(mén)氏菌的RFP-標(biāo)記的組織。用10％緩沖的福爾馬林固定所述腫瘤組織且加工成石蠟切片并標(biāo)準(zhǔn)方法作HE染色?？梢钥匆?jiàn)所述RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌在PC-3腫瘤組織中逐漸生長(zhǎng)并靶向腫瘤細(xì)胞。
實(shí)施例9在第二個(gè)試驗(yàn)中，通過(guò)組織學(xué)證明了在裸小鼠中RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌在PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤上生長(zhǎng)。如實(shí)施例8獲得切片。在注射后四天可以看見(jiàn)RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌在GFP-標(biāo)記的PC-3人類(lèi)前列腺腫瘤上生長(zhǎng)。在未治療對(duì)照中，腫瘤結(jié)構(gòu)保持良好。在用RFP-標(biāo)記的沙門(mén)氏菌治療后，腫瘤組織的大部分被毀壞并且在腫瘤中有廣泛的壞死。
實(shí)施例10將含有表達(dá)RFP的109大腸桿菌的緩沖液注射入用GFP標(biāo)記且在裸小鼠中皮下生長(zhǎng)兩星期的PC-3中。如實(shí)施例1獲得圖像。在PC-3-GFP腫瘤中可以看見(jiàn)大腸桿菌-RFP至少17天。
權(quán)利要求
1.監(jiān)視患有實(shí)體瘤的對(duì)象的腫瘤治療的過(guò)程的方法，此方法包括觀察以時(shí)間為函數(shù)的所述對(duì)象的實(shí)體瘤中熒光的存在、不存在或強(qiáng)度，其中所述對(duì)象用表達(dá)具有第一種顏色的第一熒光蛋白的細(xì)菌進(jìn)行治療，其中在所述腫瘤中所述第一熒光蛋白的熒光隨時(shí)間的分散指示所述治療的進(jìn)展。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述觀察是通過(guò)對(duì)完整對(duì)象的全身熒光視覺(jué)腫瘤成像而進(jìn)行的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述觀察是通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查法而進(jìn)行的。
4.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括觀察所述對(duì)象中腫瘤的退化或轉(zhuǎn)移，所述腫瘤用具有與第一種顏色不同的第二種顏色的第二熒光蛋白來(lái)標(biāo)記。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述對(duì)象是小鼠、大鼠或兔，它們已被改進(jìn)來(lái)包含表達(dá)所述第二熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述對(duì)象是人，且其中所述對(duì)象已被給予用于表達(dá)所述第二熒光蛋白的病毒載體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)菌被修飾來(lái)包含用于治療蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述治療蛋白是作為與熒光蛋白的融合蛋白而產(chǎn)生，該熒光蛋白與所述第一熒光蛋白的顏色不同。
10.權(quán)利要求4的方法，其中所述細(xì)菌被修飾以包含用于治療蛋白的表達(dá)系統(tǒng)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述治療蛋白是作為與具有第三種顏色的第三熒光蛋白的融合蛋白而產(chǎn)生，該第三種顏色與所述第一種和第二種顏色不同。
12.監(jiān)視對(duì)對(duì)象進(jìn)行腫瘤治療的方案的方法，此方法包括隨時(shí)間推移監(jiān)視已用細(xì)菌進(jìn)行治療的對(duì)象的實(shí)體瘤中所述熒光的存在、不存在或強(qiáng)度，其中對(duì)該細(xì)菌進(jìn)行修飾來(lái)表達(dá)與治療蛋白融合的具有第一種顏色的第一熒光蛋白；通過(guò)在所述腫瘤中所述第一熒光蛋白的熒光隨時(shí)間的存在和強(qiáng)度的維持確認(rèn)了所述治療蛋白的存在以治療該腫瘤。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述監(jiān)視是通過(guò)對(duì)所述完整對(duì)象的全身熒光視覺(jué)腫瘤成像而進(jìn)行的。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述觀察是通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查法進(jìn)行的。
15.權(quán)利要求12的方法，其進(jìn)一步包括觀察所述腫瘤的退化或轉(zhuǎn)移，其中所述腫瘤用具有與第一種顏色不同的第二種顏色的第二熒光蛋白來(lái)標(biāo)記。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述對(duì)象是小鼠、大鼠或兔，它們已被改進(jìn)來(lái)包含表達(dá)所述第二熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述對(duì)象是人，且其中已給予所述對(duì)象表達(dá)所述第二熒光蛋白的病毒載體。
18.權(quán)利要求12的方法，其中所述治療蛋白是酶，且其中該方法進(jìn)一步包括能由所述酶裂解的前藥。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述治療蛋白是蛋氨酸酶。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述治療蛋白是蛋氨酸酶且所述前藥是硒代蛋氨酸。
21.權(quán)利要求12的方法，其中進(jìn)一步修飾所述細(xì)菌來(lái)表達(dá)顏色與所述第一種顏色不同的熒光蛋白。
22.權(quán)利要求15的方法，其中已經(jīng)修飾所述細(xì)菌來(lái)表達(dá)具有與所述第一種和第二種顏色不同的第三種顏色的第三熒光蛋白。
全文摘要
使用已被改進(jìn)來(lái)表達(dá)熒光蛋白的細(xì)菌跟蹤受試者腫瘤治療進(jìn)展的方法。該方法也可以監(jiān)視與在治療過(guò)程中產(chǎn)生治療物質(zhì)的細(xì)菌有關(guān)的基因的表達(dá)，可選地在由腫瘤自身產(chǎn)生的熒光背景上。該方法使得活體對(duì)象的治療進(jìn)展可視，從而可以按照其功效改進(jìn)療法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1623001SQ02828390
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2002年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月31日
發(fā)明者趙明, 李小明, 楊萌, 徐明旭, 姜平, 李玲娜 申請(qǐng)人:抗癌公司