專利名稱：樹形聚甘油硫酸酯和磺酸酯及其對炎性疾病的用途的制作方法
樹形聚甘油硫酸酯和磺酸酯及其對炎性疾病的用途本發(fā)明涉及樹形聚甘油硫酸酯和磺酸酯的新穎的化合物種類及其制備和在治療疾病，特別是炎性疾病中的用途，并且涉及其作為選擇蛋白抑制劑和選擇蛋白指示劑的用途。樹形聚甘油硫酸酯和磺酸酯還適用于影像診斷學，特別是關于炎性疾病的影像診斷學。
背景技術：
炎癥是對組織損傷和病原體侵入的基本應答，其中由于白細胞的抗微生物活性、 分泌活性和吞噬活性，白細胞起著關鍵的作用。在所有形式的炎癥反應中均觀察到白細胞募集到血管內(nèi)皮并隨后遷移至周圍組織中。白細胞遷移至組織中是由白細胞粘附至血管壁上開始的。這允許白細胞在感染源中積聚并允許實現(xiàn)防御反應。在白細胞和內(nèi)皮細胞上的多種血管細胞粘附分子介導和調(diào)控血細胞在血管壁上的粘附。該過程是以連續(xù)相連的分子相互作用的級聯(lián)反應方式發(fā)生。首先，選擇蛋白，即凝集素樣粘附分子家族，介導白細胞在內(nèi)皮表面上的“?？俊焙汀皾L動”。這導致白細胞的減速并允許與內(nèi)皮表面上的諸如趨化因子的信號分子接觸。這些信號分子刺激白細胞表面上的整聯(lián)蛋白活化，然后該整聯(lián)蛋白又介導這些細胞在內(nèi)皮表面上的有效結(jié)合。免疫球蛋白(Ig)超家族的成員用作該整聯(lián)蛋白的配體。此時穩(wěn)定粘附的白細胞能夠以定向方式移動并能夠活躍地穿過內(nèi)皮細胞層。如前所述，通過(三種)選擇蛋白及其配體間的瞬時受體-配體相互作用來介導內(nèi)皮上白細胞的最初接觸和滾動[I]。隨后通過活化的整聯(lián)蛋白與免疫球蛋白(Ig)超家族的粘附分子之間的相互作用保證了白細胞與內(nèi)皮的緊密接觸[2]。除了所需防御作用和組織損傷的修復外，來自血流的白細胞的未受控制的遷移還能夠是病理相關的并能夠?qū)е陆M織損傷[3]。內(nèi)皮細胞粘附分子在急性和慢性炎性過程中的普遍存在使其成為診斷和治療的合適的靶標結(jié)構(gòu)[綜述參見4]。選擇蛋白是結(jié)合碳水化合物的粘附分子，其有助于增強白細胞在免疫防御過程中粘附至發(fā)炎組織的血管內(nèi)皮上。根據(jù)其細胞來源，選擇蛋白可分為L-選擇蛋白(白細胞)、 E-選擇蛋白(內(nèi)皮)和P-選擇蛋白(血小板和內(nèi)皮)。由于其蛋白結(jié)構(gòu)及其特定分子結(jié)合特性，選擇蛋白引起白細胞粘附；在相應配體的臨時結(jié)合后，白細胞沿著血管壁邊從流暢的血流中經(jīng)歷了“滾動減速”。然后，其它粘附分子介導白細胞緊密結(jié)合至內(nèi)皮上及其為了完成其防御功能的外滲。在發(fā)現(xiàn)選擇蛋白后不久并在90年代初期闡明其結(jié)構(gòu)之后，選擇蛋白在醫(yī)藥研究領域成為引人注目的靶標結(jié)構(gòu)。除了其在免疫應答中的生理學功能之外，在病理過程中還觀察到選擇蛋白表達的失調(diào)，所述病理過程例如類風濕性關節(jié)炎、哮喘、糖尿病和缺血/再灌注，以及在轉(zhuǎn)移性癌細胞的組織侵入期間觀察到它的存在。這激發(fā)了對抑制選擇蛋白的化合物進行深入細致的探索。E-選擇蛋白和P-選擇蛋白以及L-選擇蛋白配體以炎癥依賴性方式在微血管內(nèi)皮上表達，L-選擇蛋白在白細胞上出現(xiàn)[1，2]。對于所報導的選擇蛋白，僅有幾種高度親和的配體是已知的。大體上，它們具有粘蛋白樣結(jié)構(gòu)，例如長延伸的糖蛋白，該結(jié)構(gòu)具有許多個作為實際結(jié)合表位的碳水化合物側(cè)鏈，該側(cè)鏈以糖苷形式連接在所述結(jié)構(gòu)的富絲氨酸或富蘇氨酸的蛋白骨架上。通過受體與高柔韌性配體的結(jié)合物的快速形成和解離，在脈管的剪切流中介導細胞滾動。結(jié)合所必需的碳水化合物表位是帶有特異性連接的海藻糖和末端的唾液酸(N-乙?；窠?jīng)氨酸)的、基于N-乙?；樘前返墓烟?。四糖唾液酸化的 LewisX(sLeX)是顯著相關的結(jié)合表位。sLeX用作結(jié)構(gòu)-功能關系的標準配體以表征結(jié)合特性以及探求選擇蛋白抑制劑。很久以來，已知sLeX是選擇蛋白的重要結(jié)合伙伴以及多價是靶向阻斷白細胞粘附的關鍵，這些研究成果是開發(fā)多種選擇蛋白抑制劑的基礎[綜述參見5]。到目前為止， 盡管可以得到高親和的抑制劑，但靶標選擇蛋白還未導致開發(fā)出市場準備完畢的治療方法。目前，通過使用炎性細胞因子TNF α的阻斷劑(英夫利西單抗(infliximab),依那西普(etanerc印t)[6，7])，實現(xiàn)了類風濕性關節(jié)炎和牛皮癬情況下的治療性干預。此外，依法利珠單抗(efalizumab) [7]，抗-整聯(lián)蛋白抗體，在市場上出售，其被批準用于全身治療牛皮癬。在臨床試驗中測試了更多的化合物，例如全-選擇蛋白拮抗劑雙莫昔氨莫司 (bimosiamose) (1,6-雙[3_(3_羧甲基苯基)_4_(2_ a-D-卩比喃甘露糖基氧基)苯基]己烷)，其屬于小分子藥物類，并且是具有糖苷結(jié)構(gòu)的抑制選擇蛋白的化合物，其具有比sLeX 基本上更高的對選擇蛋白的親和性(試驗由Revotar AG, Hennigsdorf進行)。雙莫昔氨莫司被期望用于哮喘、牛皮癬、特應性皮炎和再灌注損傷[8]。已經(jīng)描述了帶有硫酸化的sLeX結(jié)構(gòu)的線性新含糖聚合物(neoglycopolymer)且其能夠獲得在低納米摩爾范圍的IC5tl值[5，9]，還描述了硫酸化的樹形聚環(huán)氧乙烷(PEO)含糖聚合物[10]。因此，本發(fā)明的一目的是提供易于合成并且適用于治療疾病，特別是治療炎性疾病的化合物和化合物類型。通過提供樹形聚甘油磺酸酯，本發(fā)明解決了所述目的。本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核,其由在多官能團的起動分子(starter molecule)上的具有通式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元組成，所述起分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，優(yōu)選I至4個OH基團，其中R = H或更多的甘油單元，所述核的支化度為O至100%，優(yōu)選60%，且其平均分子量為lOOg/mol至 I, 000, 000g/mol，優(yōu)選 1，000g/mol 至 20，000g/mol,b)用-SO3H或-SO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團或在甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基，所述低聚物間隔基的通式為-(CH2)n-或-[(CH2) ^-(^^-，其中!!!* I至100并且η為I至50，000，且在其上結(jié)合-SO3H或-SO3Na基團，因此得到1%至100%的磺化度，優(yōu)選I %至30%，和c)分子量為 110g/mol 至 1，500, 000g/mol,優(yōu)選 1，100g/mol 至 30，000g/mol。通過在縮水甘油的開環(huán)聚合期間，分別使用具有(多)官能團的起動分子或引發(fā)劑制備所述高分子聚甘油核。起動分子或引發(fā)劑分別為具有I至1000個OH基團的多羥基化合物，優(yōu)選I至100個OH基團且更優(yōu)選I至4個OH基團。起動分子的通式為R-(OH)x, 其中R能夠是在陰離子聚合條件下穩(wěn)定的任何分子，且X是I至1000，優(yōu)選I至100且更優(yōu)選I至4。優(yōu)選地，所用的引發(fā)劑是三官能團引發(fā)劑或四官能團引發(fā)劑，例如1，1，1_三羥甲基丙烷(TMP)作為優(yōu)選的三官能團引發(fā)劑或季戊四醇(PE)作為優(yōu)選的四官能團引發(fā)劑。 起動分子或引發(fā)劑能夠分別帶有更多的雜官能團，例如特別是SH基團、NH2基團。在具體實施方案中，所述起動分子含有OH基團和/或更多的雜官能團(如SH、NH2)。本領域技術人員已知更多合適的引發(fā)劑。取決于對引發(fā)劑和聚合條件的選擇，所述高分子聚甘油核達到一定的支化度和具有窄的多分散性的可任意調(diào)整的分子量。根據(jù)本發(fā)明，使用支化度為O至100%的高分子聚甘油核。優(yōu)選地，使用高支化的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選30%至80%的支化度，特別優(yōu)選60%的支化度。本發(fā)明的高分子聚甘油核的平均分子量優(yōu)選100g/mol至1，000，000g/mol,更優(yōu)選 500g/mol 至 100，000g/mol,其中特別優(yōu)選 1，000g/mol 至 20，000g/mol。將本發(fā)明的高分子聚甘油核進行磺化。優(yōu)選地，在催化量的諸如氫氧化鉀的堿存在下使用乙烯基磺酸的鈉鹽作為磺化試劑。所達到的磺化度優(yōu)選1%至100%，特別優(yōu)選 10%至30%，更特別優(yōu)選30%至100%。本發(fā)明的“磺化度”意指高分子聚甘油核的甘油單元的被官能化的OH基團的百分比。官能化或者是由用-SO3H或-SO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團而引起的， 或者是由在甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基而引起的。所述低聚物間隔基具有以下通式- (CH2) n-或- [ (CH2) m-0) ] n-其中m為I至100，優(yōu)選I至50，更優(yōu)選I至10且還更優(yōu)選2，并且η為I至50，000，優(yōu)選I至5，000,更優(yōu)選I至100并且在其上結(jié)合-SO3H或-SO3Na 基團。低聚物間隔基例如是低聚乙二醇(OEG)鏈、聚乙二醇(PEG)鏈、脂肪族碳水化合物鏈或其它線性聚醚。取決于對本發(fā)明的高分子聚甘油核和磺化條件、即磺化度的選擇，本發(fā)明的所述樹形聚甘油磺酸酯的分子量優(yōu)選為110g/mol至1，500，000g/mol,更優(yōu)選為600g/mol至 150，000g/mol 且特別優(yōu)選 1，100g/mol 至 30，000g/mol。本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯的特別優(yōu)選的實施方案具有a)高分子聚甘油核，其平均分子量(Mn)為2，500g/mol至20，000g/mol且支化度為60 %，該支化度對應于樹形支化度，和b)磺化度為10%至30%，這是通過用乙烯基磺酸的鈉鹽進行磺化而獲得。本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯的特別優(yōu)選的實施方案具有平均分子量為5，OOOg/ mo I的高分子聚甘油核、4%的磺化度和5，200g/mol的分子量，例如實施例2中的化合物 3b (參見表2)。本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯的又一特別優(yōu)選的實施方案具有平均分子量為 20，000g/mol的高分子聚甘油核、8%的磺化度和21，800g/mol的分子量，例如實施例2中的化合物3d (參見表2)。本發(fā)明還通過提供樹形聚甘油硫酸酯解決所述目的。本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯的特征在于
a)高分子聚甘油核，其由在多官能團的起動分子上的具有通式(RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元組成，所述起動分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，優(yōu)選I至 4個OH基團，其中R = H或更多的甘油單元，所述核的支化度為O至100%，優(yōu)選60%，且其平均分子量為lOOg/mol至 I, 000, 000g/mol,優(yōu)選 1，000g/mol 至 20，000g/mol,更優(yōu)選 2，000g/mol 至 7，500g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團或在甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基，所述低聚物間隔基的通式為-(CH2)n-或-[(CH2)m-0)]n-，其中m為I至100并且η 為I至50，000，且在其上結(jié)合-OSO3H或-OSO3Na基團，因此得到I %至100%的硫酸化度，以及c)分子量為 200g/mol 至 5，000, 000g/mol,優(yōu)選 2，000g/mol 至 50，000g/mol,更優(yōu)選 5，000g/mol 至 13，500g/mol。通過在縮水甘油的開環(huán)聚合期間，分別使用具有(多)官能團的起動分子或引發(fā)劑制備所述高分子聚甘油核。起動分子或引發(fā)劑分別為具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，優(yōu)選I至100個OH基團且更優(yōu)選I至4個OH基團。起動分子的通式為R-(OH) x，其中R能夠是在陰離子聚合條件下穩(wěn)定的任何分子，X是I至1，000，優(yōu)選I至100且更優(yōu)選I至4。優(yōu)選地，所用的引發(fā)劑是三官能團引發(fā)劑或四官能團引發(fā)劑，例如1，1，I-三羥甲基丙烷(TMP)作為優(yōu)選的三官能團引發(fā)劑或季戊四醇(PE)作為優(yōu)選的四官能團引發(fā)劑。 起動分子或引發(fā)劑能夠分別帶有更多的雜官能團，例如特別是SH基團、NH2基團。在具體實施方案中，所述起動分子含有OH基團和/或更多的雜官能團(如SH、NH2)。本領域技術人員已知更多合適的引發(fā)劑。取決于對引發(fā)劑和聚合條件的選擇，所述高分子聚甘油核達到一定的支化度和具有窄的多分散性的可任意調(diào)整的分子量。根據(jù)本發(fā)明，使用支化度為O至100%的高分子聚甘油核。優(yōu)選地，使用高支化的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選30%至80%的支化度，特別優(yōu)選60%的支化度。本發(fā)明的高分子聚甘油核的平均分子量優(yōu)選100g/mol至1，000，000g/mol,更優(yōu)選 500g/mol 至 100，000g/mol，其中特別優(yōu)選 1，000g/mol 至 20，000g/mol 以及 2，000g/mol 至 7，500g/molο將本發(fā)明的高分子聚甘油核進行硫酸化。優(yōu)選地，使用SO3和吡啶的配合物作為硫酸化試劑，且其濃度為與所述高分子聚甘油核的OH基團等摩爾。通過SO3與聚甘油的OH 基團的比例能夠調(diào)節(jié)所得官能化，即硫酸化為O至100%。所達到的硫酸化度優(yōu)選I %至 100%,特別優(yōu)選70%至95%，更特別優(yōu)選75%至92%。本發(fā)明的“硫酸化度”意指高分子聚甘油核的甘油單元的被官能化的OH基團的百分比。官能化或者是由用-OSO3H或-OSO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團而引起的，或者是由在甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基而引起的。所述低聚物間隔基具有以下通式-(CH2)n-或- [ (CH2) m-0) ] n-
其中m為I至100，優(yōu)選I至50，更優(yōu)選I至10且還更優(yōu)選2，并且η為I至50，000，優(yōu)選I至5，000，更優(yōu)選I至100并且在其上結(jié)合-OSO3H
或-OSO3Na基團。低聚物間隔基例如是低聚乙二醇(OEG)鏈、聚乙二醇(PEG)鏈、脂肪族碳水化合物鏈或其它線性聚醚。取決于對本發(fā)明的高分子聚甘油核和硫酸化條件、即硫酸化度的選擇，本發(fā)明的所述樹形聚甘油硫酸酯的分子量優(yōu)選200g/mol至5，000, 000g/mol,更優(yōu)選2，000g/mol至 50，000g/mol 且特別優(yōu)選 5，000g/mol 至 13，500，特別優(yōu)選 5，500g/mol 或 11，000g/mol 或 21, 500g/mol 或 41，000g/mol 或 6，800g/mol 或 8，600g/mol 或 12，300g/mol。本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯的特別優(yōu)選的實施方案具有平均分子量為2，500g/ mo I的高分子聚甘油核、85%的硫酸化度和5，500g/mol的分子量，例如分別為實施例I中的化合物2a(參見表I)或?qū)嵤├?中的dPGS2500/85化合物(參見表3)。本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯的另一特別優(yōu)選的實施方案具有平均分子量為 5，000g/mol的高分子聚甘油核、79%的硫酸化度和10，500g/mol的分子量，例如實施例I中的化合物2b (參見表I)。本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯的另一特別優(yōu)選的實施方案具有平均分子量為 2，500g/mol的高分子聚甘油核、92%的硫酸化度和6，800g/mol的分子量，例如實施例4中的化合物dPGS2500/92 (參見表3)。本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯的另一特別優(yōu)選的實施方案具有平均分子量為 4，000g/mol的高分子聚甘油核、84%的硫酸化度和8，600g/mol的分子量，例如實施例4中的化合物dPGS4000/84 (參見表3)。本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯的另一特別優(yōu)選的實施方案具有平均分子量為 6，000g/mol的高分子聚甘油核、76%的硫酸化度和12，300g/mol的分子量，例如實施例4中的化合物dPGS6000/76 (參見表3)。通過使用本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯作為用于治療疾病的藥物進一步解決了所述目的。本發(fā)明的化合物能夠例如在用作藥劑時以藥物組合物的形式提供，所述藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的化合物以及藥物可接受的載體。優(yōu)選地，這些藥物組合物具有單位劑型，例如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、無菌腸胃外溶液劑或混懸劑。本領域技術人員已知更多的劑型。藥劑或藥物組合物包含治療有效量的藥物或若干藥物，即治療有效量的一種或多種本發(fā)明的化合物。技術人員能夠根據(jù)待治療的疾病并考慮患者的狀態(tài)而確定治療有效量。藥劑或藥物組合物能夠適當?shù)匕s5mg至1，OOOrng、優(yōu)選約IOmg至500mg的本發(fā)明的化合物。取決于所需的應用途徑(例如口服、腸胃外給藥)，藥物可接受的載體和/或賦形劑能夠具有多種形式。合適的載體和賦形劑是本領域公知的并且能夠由本領域技術人員選擇。載體包括惰性的藥物賦形劑，例如粘合劑、助懸劑、潤滑劑、矯味劑、增甜劑、防腐劑、著色劑和包衣劑。能夠通過使用本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯而治療的疾病優(yōu)選炎性疾病。對于治療性干預，考慮全部的炎癥過程，其中白細胞從血流中的遷移是病理上相關的并且導致組織損傷。除了慢性炎性疾病外，例如類風濕性關節(jié)炎、哮喘和牛皮癬，還可以在缺血再灌注損傷或移植排斥的情況下使用本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯。因此，本發(fā)明的化合物優(yōu)選用于治療慢性炎性疾病，特別是類風濕性關節(jié)炎、哮喘和牛皮癬，以及用于治療缺血再灌注損傷或移植排斥。更優(yōu)選地，所述炎性疾病為這樣的疾病，其中選擇蛋白介導的白細胞粘附是失調(diào)的。本發(fā)明的化合物的抗炎作用能夠，例如，歸因于由其介導的白細胞游出的減少。因此，大大降低了更多的免疫細胞被炎癥部位處分泌的細胞因子所活化(更詳細的細節(jié)參見實施例)。在慢性炎癥過程中，組織損傷后出現(xiàn)了纖維化。從而，兩種細胞因子起重要作用 IFNy和TNFa。IFNy由特定群體的白細胞(T細胞和NK細胞)分泌并導致巨噬細胞的活化，其又I)產(chǎn)生水解酶及活性的氧和氮物質(zhì)，這些導致鄰近組織的破壞，以及2)釋放TNFa，TNFa導致在鄰近內(nèi)皮上細胞粘附分子的表達增加以及白細胞的活化。因此，在炎性區(qū)域觀察到白細胞的募集增加。通過使用本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯作為選擇蛋白抑制劑進一步解決了所述目的。因此，優(yōu)選地用作L-選擇蛋白和/或P-選擇蛋白的抑制劑。本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯以高親和力(IC5tl 分別為IOnM或40nM，參見實施例3)結(jié)合L-選擇蛋白和P-選擇蛋白并因此阻止與其配體的相互作用。白細胞-內(nèi)皮的接觸減少了并且因此抑制了白細胞向炎癥部位增加的遷移。因此，本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯適于抑制選擇蛋白介導的白細胞粘附。通過使用本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯作為選擇蛋白指示劑進一步解決了所述目的。本發(fā)明的“選擇蛋白指示劑”特異性結(jié)合多種選擇蛋白或特異性結(jié)合選擇蛋白之一，諸如L-選擇蛋白和/或P-選擇蛋白，并因此能夠特別在體外、在細胞、組織、器官、組織切片中，但還是特別在體內(nèi)靶向、定位和/或顯現(xiàn)選擇蛋白。通過應用本專利申請的教導， 技術人員能夠?qū)⒈景l(fā)明的化合物用作選擇蛋白指示劑。為了該目的，本發(fā)明的化合物優(yōu)選地被負載有信號分子或使信號分子與本發(fā)明化合物結(jié)合。優(yōu)選的信號分子是用諸如1241、1251、或18F的放射性同位素標記的分子；用染料標記的分子，特別是用諸如氨甲基香豆素、熒光素、花青、若丹明及其衍生物的熒光團或其它生色團標記的分子。信號分子還能夠是熒光供體或指示劑以及熒光受體或猝滅劑，其能夠特別用作每一熒光供體/指示劑和熒光受體/猝滅劑對(即，用作FRET對)。
目前為止，通過可用的影像臨床診斷方法解決炎癥源的定位和表征并不令人滿意。對于采用本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯特異性靶向炎癥區(qū)域，這些化合物被負載有信號供體(放射性同位素、NIR染料、磁鐵礦)并用于顯影。因此，必要條件是在炎癥區(qū)域的特異性結(jié)合(L-選擇蛋白和P-選擇蛋白)和信號積聚。因此，本發(fā)明的化合物優(yōu)選用于炎性疾病的診斷。從而，在炎性區(qū)域發(fā)生選擇蛋白的靶向。本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯還用作肝素類似物并因此如同肝素一樣能夠特異性結(jié)合某些趨化因子。這些趨化因子是促炎細胞因子，特別是 TNFa、IL-I、IL-6 以及 IL-8 和 MIP-I β。本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯對諸如INFy或 TNFa的趨化因子的抑制性結(jié)合阻止了與趨化因子的受體的相互作用，這導致降低的組織損傷和白細胞外滲。由于其與諸如選擇蛋白、趨化因子、凝血因子、特別是L-選擇蛋白和P-選擇蛋白等蛋白的特異性相互作用，本發(fā)明的化合物優(yōu)選用于更多的體外應用-本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯(類似于市售的肝素瓊脂糖凝膠)被固定在基質(zhì)上。取決于用途，例如所用的分離技術，優(yōu)選的用于固定的基質(zhì)或表面分別為無機的材料以及聚合的天然材料和聚合的合成材料。實例有基于硅的表面(例如玻璃、硅石)和多種官能化的和非官能化的聚合物(例如葡聚糖、瓊脂糖、瓊脂糖凝膠以及合成的親水性聚合物)。用于固定的基質(zhì)或表面還可分別選自無機氧化物表面、能磁化的或不能磁化的表面、含娃的表面、玻璃表面、二氧化娃膜、娃土、粘土和技術人員公知的更多的表面。用于固定的基質(zhì)或表面還能夠分別為顆粒、膜、基質(zhì)或固相。-本發(fā)明的化合物，優(yōu)選被固定的，用于配合物溶液或生物樣品(例如體液；血漿； 全血；血清；更多源于血的樣品；細胞懸浮液；細胞培養(yǎng)液的上清液)及其它含生物分子的溶液的分部以及用于從這些溶液/樣品中純化特定蛋白(例如L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、 趨化因子、凝血因子)。-本發(fā)明的樹形聚甘油磺酸酯和/或本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯用作捕捉分子， 例如在ELISA中。所述樹形聚甘油硫酸酯和磺酸酯具有很強的抗炎潛力，因為其結(jié)合了所報導的抑制劑的優(yōu)點-容易合成(成本效益)-生物相容性(與硫酸乙酰肝素/肝素高度相似)-對L-選擇蛋白和P-選擇蛋白具有高親和性(IC5tl分別=IOnM或40ηΜ，體外測量)。在Biacore中體外分析顯示，取決于其大小，其活性(結(jié)合L-選擇蛋白和P-選擇蛋白)增強。-與抑制白細胞活化的趨化因子結(jié)合。還公開了本發(fā)明的樹形聚甘油硫酸酯作為白細胞-內(nèi)皮相互作用的抑制劑，其中 L-選擇蛋白和P-選擇蛋白配體的結(jié)構(gòu)被簡化為硫酸酯基團并與聚甘油骨架連接。在接觸性皮炎小鼠模型中安全地使用了所述化合物并抑制了免疫應答(還參見實施例和附圖)。通過以下附圖和實施例對本發(fā)明進行說明。


圖I.樹形聚甘油硫酸酯的合成方案。
圖2.樹形聚甘油磺酸酯的合成方案。
圖3.所選的樹形聚甘油硫酸酯對L-選擇蛋白配體結(jié)合的抑制作用。
L-選擇蛋白與其合成的配體(sLeX-酪氨酸硫酸鹽)的結(jié)合被設定為100% (對照值)。
聚甘油核的平均分子量[g/mol] 2a, 2500 ；2c, 10, 000 ;2d，20，000。
全部聚甘油硫酸酯的硫酸化度為約80% (還參見表I)。
圖4.樹形聚甘油硫酸酯2c對選擇蛋白的競爭抑制作用。
與合成的配體(sLeX-酪氨酸硫酸鹽)的結(jié)合被分別設定為100% (對照值)。
圖5.樹形聚甘油衍生物2d對L-選擇蛋白配體結(jié)合的硫酸化度依賴性競爭抑制作用。
以IOnM的濃度使用該衍生物。L-選擇蛋白與其合成的配體(sLeX-酪氨酸硫酸鹽)的結(jié)合被設定為100% (對照值)。
圖6.樹形聚甘油硫酸酯的實例(dPGS)。
圖7. dPGS不抑制單核細胞系THP-I的增殖。
增殖試驗阿爾瑪藍染料(Alamar Blue)。
與潑尼松龍相對照，T細胞的存活力未受不同濃度的dPGS的影響。
圖8. dPGS未顯示出誘導PBMC細胞凋亡。
A PBMC+dPGS (+/-CD3 刺激)
B PBMC+dPGS (+/-LPS 刺激)
細胞凋亡檢測=Annexin V讀出
圖9. dPGS在鼠樹突狀細胞(DC)中未抑制TNFa分泌。
鼠樹突狀細胞+dPGS (+/-LPS)
檢測=ELISA0
圖10. dPGS在人T細胞中未顯示出對TNFa分泌的干預。
PBMC+/-抗 CD3 珠 +dPGS
檢測=ELISA0
圖11. dPGS的選擇蛋白結(jié)合特異性
使用聚合物核的Mn為4，000g/mol且硫酸化度為84%的dPGS (dPGS4000/85)。
圖12.選擇蛋白的結(jié)合依賴于樹形聚甘油的硫酸化。
使用聚合物核的Mn為6，000g/mol的dPGS (dPG 6000)。
圖13. dPGS對選擇蛋白的結(jié)合依賴于核的大小和硫酸化率。
圖14.在急性TMA-誘導的變應性接觸性皮炎模型中dPGS降低水腫形成。
dPGS被注入小鼠的頸褶。
圖15.在急性TMA-誘導的變應性接觸性皮炎后dPGS降低粒細胞的遷出。
dPGS被注入小鼠的頸褶。圖16.在亞慢性TMA-誘導的變應性接觸性皮炎模型中dPGS降低水腫形成。圖17.在亞慢性TMA-誘導的變應性接觸性皮炎模型中dPGS防止粒細胞和嗜中性粒細胞的浸潤。A :粒細胞(過氧化物酶活性)B :嗜中性粒細胞(彈性蛋白酶活性)，歸一化至介質(zhì)(=O)圖18. dPGS降低炎癥部位的IL-2和IL-4的濃度。亞慢性TMA 激發(fā)，耳勻衆(zhòng)(ear homogenate)的 ELISA。
實施例實施例I :樹形聚甘油硫酸酯的合成基本上按照[11]中所述進行樹形聚甘油硫酸酯的合成材料從Fluka (BuchsJi^i)購買SO3/卩比唳配合物。該試劑不經(jīng)過進一步純化就使用。 在進一步使用前，溶劑N，N-二甲基甲酰胺(DMF，p.a.質(zhì)量，購自Roth，卡爾斯魯厄，德國) 用CaH2干燥并經(jīng)4人分子篩儲存。在51燒杯中，在蒸餾水中用再生纖維素管(SpectraPore 6/Roth)進行滲析，其中所述溶劑在48小時內(nèi)更換3次。I.高分子聚甘油核聚甘油I是具有樹形(樹樣的)分支的、易于獲得的、明確定義的聚合物，其通過縮水甘油的受控陰離子聚合而得到[12-14]。I的支化度(60% )低于理想的甘油樹枝狀聚合物(100%) [15]。然而，物理化學特性是類似的[16]。通過單體和引發(fā)劑的比例能夠容易地調(diào)節(jié)分子量(1，000-30, 000g/mol)和聚合度(DP)，并且得到窄的多分散性(通常< 2. 0)。由于脂肪族聚醚的生物相容特性，大體上具有相似特性的多羥基化合物(例如多糖類、聚(乙二醇)類)被預期為聚甘油[13]。此外，詳細研究了低聚甘油(2-10個單體單元)的毒理學特性并證明其可作為營養(yǎng)添加劑和藥理學添加劑[16，17]。因此，樹形聚甘油 I應當適于作為藥物的高功能載體并且適于產(chǎn)生樹形聚陰離子(聚硫酸酯、聚羧酸酯、聚磺酸酯)。此外，如前所述[14]，對于la-c的情況，使用1，1，1_三(羥甲基)丙烷(TMP)作為引發(fā)劑來制備聚甘油(PG) la (Mn = 2，500g/mol, Mw/Mn = I. 6)、Ib (Mn = 5，000g/mol, Mw/ Mn =1.6)、Ic (Mn = 10，OOOg/mol，Mw/Mn =1.8)，而對于 Id 的情況則使用季戊四醇(PE)作為引發(fā)劑來制備聚甘油(PG) Id (Mn = 20，000g/mol, Mw/Mn < 2. 0)。2.分析在fcuker ARX 300光譜儀中，在濃度為100mg/ml的D2O中記錄1HNMR和13C NMR 圖譜，分別在300MH或75. 4MH中操作。在Bruker IFS88FT-IR中使用KBr板進行IR測量。 使用元素分析測定化合物2a-d的硫酸化度(ds)(表I)。3.聚甘油硫酸酯的合成通過修改Alban等人描述的已有的硫酸化β_1,3_葡聚糖的方法[18],使用不同分子量的樹形聚甘油(la-d)作為核聚合物以及SO3/吡啶配合物作為硫酸化試劑在作為溶劑的干燥DMF中進行聚甘油硫酸酯的合成(參見方案I)。SO3/吡啶配合物在DMF中的濃度及其摩爾比(SO3每OH基團)在所有情況下均保持恒定。合成方案參見圖I。在60°C、氬氣氣氛下，將10. 75g(67. 5mmol) SO3/吡啶配合物的67. 5ml DMF溶液在 4小時內(nèi)逐滴加入攪拌中的5. Og聚甘油(la、lb、lc、ld) (67. 5mmol OH基團)的25ml DMF 溶液。將該反應混合物在60°C下再攪拌2小時并在室溫下攪拌18小時后，加入50ml蒸餾水。立即將IM NaOH加入該水溶液中直至pH達到11。真空濃縮得到粗產(chǎn)物，通過在水中滲析將其進一步純化。蒸發(fā)溶劑后得到聚甘油硫酸酯2a-d淡黃色固體，將其用P2O2進一步干燥。在蒸餾水中滲析后，以良好的收率(50-75% )且高純度(根據(jù)1H NMR, > 98% ) 獲得聚甘油硫酸酯(2a_d)。產(chǎn)量7.49g(2a)；8. 96g(2b) ；7. 01g(2c) ;6.86g(2d)。1H NMR (300MHz, D2O) δ (ppm) 0. 98 [t，3H，CH3CH2C (CH2O) 3-PG_0S03Na]，I. 48 [m， 2H, CH3CH2C- (CH2O) 3-PG_0S03Na]，3. 40-4. 00 [m, CH3CH2C (CH2O) 3-PG_0S03Na] ,4. 19, 4. 33，
4.38 [PG-OSO3Na]，4. 72 [PG-OCH2CH (OSO3Na) CH2OSO3Na]。注意對于2d的情況,0. 98和I. 48處的峰不適用。13C NMR (D2O, 75. 4ΜΗζ) δ (ppm) 66. 9,67. 6,68. 2,69. 4, 70. 3, 75. 8, 77. 2,
78. 3 [PG-OSO3Na]。IR (KBr) υ (cm-1) 3470 [OH]，2930 [CH]，1260 [S = 0]，780 [C-O-S]。元素分析后的硫含量2a15. 38% S，2b :14. 28% S，2c :15. 20% S，2d :13. 96%。通過1H-NMR光譜法，未觀察到聚甘油核的降解。使用與OH基團等摩爾的SO3/吡啶濃度，全部游離OH基團中約85%的OH基團被硫酸化(表I)。如此高的硫酸化度表明聚甘油比多糖(24)更易于硫酸化。表I樹形聚甘油硫酸酯2a-C的表征
權利要求
1.樹形聚甘油硫酸酯，其特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能團的起動分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元組成，所述起動分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，其中R = H或更多的甘油單元，所述核的支化度為O至100%，并且所述核的平均分子量為100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團或在所述甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基，所述低聚物間隔基的通式為-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m為I至100并且η為I至50，000，且在其上結(jié)合-OSO3H 或-OSO3Na 基團，因此得到92%至100%的硫酸化度，以及c)分子量為200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
2.如權利要求I所述的樹形聚甘油硫酸酯，其特征在于b)硫酸化度為92%至95%。
3.如權利要求I或2所述的樹形聚甘油硫酸酯，其特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量為1，000g/mol至20，000g/mol。
4.如權利要求3所述的樹形聚甘油硫酸酯，其特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量為2，000g/mol至7，500g/mol。
5.如權利要求I或2所述的樹形聚甘油硫酸酯，其特征在于c)分子量為2000g/mol 至 50，000g/mol。
6.負載有信號分子或具有與其結(jié)合的信號分子的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能團的起動分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元組成，所述起動分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，其中R = H或更多的甘油單元，所述核的支化度為O至100%，并且所述核的平均分子量為100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團或在所述甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基，所述低聚物間隔基的通式為-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m為I至100并且η為I至50，000，且在其上結(jié)合-OSO3H 或-OSO3Na 基團，因此得到1%至100%的硫酸化度，以及c)分子量為200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
7.如權利要求6所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述信號分子選自放射性標記的衍生物或染料團。
8.如權利要求7所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述信號分子選自熒光團和生色團。
9.如權利要求6或7所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)在具有I至4個OH基團的多官能團的起動分子上建立高分子聚甘油核。
10.如權利要求6或7所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)在還包含雜官能團的多官能團的起動分子上建立高分子聚甘油核。
11.如權利要求10所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述雜官能團選自SH基團和見12基團。
12.如權利要求6或7所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核的支化度為60%。
13.如權利要求6或7所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量為1，000g/mol至20，000g/mol。
14.如權利要求13所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核的平均分子量為2，000g/mol至7，500g/mol。
15.如權利要求6或7所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于c)分子量為 2，000g/mol 至 50，000g/molo
16.如權利要求15所述的樹形聚甘油硫酸酯，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于c)分子量為 5，000g/mol 至 13，500g/mol。
17.負載有信號分子或具有與其結(jié)合的信號分子的樹形聚甘油硫酸酯在制備診斷炎性疾病的藥物中的用途，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能團的起動分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元組成，所述起動分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，其中R = H或更多的甘油單元，所述核的支化度為O至100%，并且所述核的平均分子量為100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團或在所述甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基，所述低聚物間隔基的通式為-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m為I至100并且η為I至50，000，且在其上結(jié)合-OSO3H 或-OSO3Na 基團，因此得到1%至100%的硫酸化度，以及c)分子量為200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
18.任選地負載有信號分子或具有與其結(jié)合的信號分子的樹形聚甘油硫酸酯在制備與蛋白結(jié)合的藥物中的用途，其中所述蛋白是選擇素或細胞因子，其中所述樹形聚甘油硫酸酯的特征在于a)高分子聚甘油核，所述高分子聚甘油核由在多官能團的起動分子上的具有通式 (RO-CH2)2CH-OR的甘油重復單元組成，所述起動分子是具有I至1，000個OH基團的多羥基化合物，其中R = H或更多的甘油單元，所述核的支化度為O至100%，并且所述核的平均分子量為100g/mol至1，000，000g/mol,b)用-OSO3H或-OSO3Na基團取代甘油單元的一個或多個OH基團或在所述甘油單元的一個或多個OH基團上連接低聚物間隔基，所述低聚物間隔基的通式為-(CH2)n-或_[ (CH2)m-O) ]n-，其中m為I至100并且η為I至50，000，且在其上結(jié)合-OSO3H 或-OSO3Na 基團，因此得到1%至100%的硫酸化度，以及c)分子量為200g/mol 至 5，000, 000g/mol。
全文摘要
本發(fā)明涉及樹形聚甘油硫酸酯和磺酸酯的新穎的化合物種類及其制備和在治療疾病，特別是炎性疾病中的用途，并且涉及其作為選擇蛋白抑制劑和選擇蛋白指示劑的用途。樹形聚甘油硫酸酯和磺酸酯還適用于影像診斷學，特別是關于炎性疾病的影像診斷學。
文檔編號A61P9/10GK102585202SQ201110436548
公開日2012年7月18日 申請日期2007年8月3日 優(yōu)先權日2006年8月3日
發(fā)明者烏爾里?！そM格爾, 戈斯徹·伯恩哈德, 斯文·恩德斯, 海德馬瑞·韋恩哈特, 萊納·哈格, 詹斯·德納德, 阿尼·馮邦恩, 霍格爾·圖爾克, 魯?shù)婪颉ぬ詹紶?申請人:夏里特柏林大學醫(yī)學院, 柏林自由大學