專利名稱：基因limg編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在乳腺癌診斷和/或治療中的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體，具體講，涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體的在乳腺癌診斷和/或治療中的應用。
背景技術(shù)：
UMG基因位于人9號染色體長臂，全長453個堿基，由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成。我們克隆到的LIMG的ORF有453個堿基，編碼一個150個氨基酸的蛋白，預測分子量為17kDa。圖I為UMG的基因結(jié)構(gòu)示意圖，UMG基因ORF為150個氨基酸，下劃線部分為EF-hand(52-112aa)結(jié)構(gòu)域，下方所示為LIMG的蛋白序列。 在現(xiàn)有技術(shù)的報道中，還沒有該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的功能的報道，為了進一步研究該基因及其編碼的蛋白質(zhì)的功能，發(fā)明人進行了深入的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應用。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出一種用于診斷乳腺癌的試劑盒。本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出基因UMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應用。為了完成本發(fā)明的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為本發(fā)明涉及基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應用。其中，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選電泳法、免疫印跡法、雙抗體夾心法。當采用定量PCR法檢測基因UMG的表達，用定量PCR儀檢測，當待測組的基因LIMG水平為正常參比組基因UMG水平2±0. 05倍及以上時，判定為陽性；采用ELISA免疫檢測法檢測UMG編碼的蛋白時，當待測組的基因UMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因LMG水平2±0. 05倍及以上時，判定為陽性。本發(fā)明還涉及一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，該試劑盒為定量PCR的試劑盒，包括提取DNA的試劑盒、正常參比組的DNA、UMG基因的引物。本發(fā)明還涉及另一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，該試劑盒采用免疫檢測法，包括提取蛋白質(zhì)的試劑盒、LMG抗體包被的孔板、LIMG的單克隆或多克隆抗體、作為濃度參比標準的UMG純化蛋白、第二抗體、ELISA顯色試劑，用于檢測的酶標儀，其中，UMG抗體為單抗或多抗。本發(fā)明還涉及基因UMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應用。所述的基因UMG在性激素及類似物的作用下增加表達。
經(jīng)動物實驗表明，當刺激UMG的表達增加時，雌性小鼠的乳腺發(fā)育加快。前期試驗證明UMG基因直接作用于0ct4等轉(zhuǎn)錄因子，這些因子對于細胞的自我更新和繁殖十分重要。LIMG基因為刺激乳腺增長和發(fā)育提供了一個新的途徑。本發(fā)明還涉及基因UMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在檢測乳腺發(fā)育中的應用。其中，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選定量PCR、免疫印跡法、雙抗體夾心法。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的詳細描述本發(fā)明涉及基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應用。其中，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選電泳法、免疫印跡法、雙抗體夾心法。當采用定量PCR法檢測基因LIMG的表達，用定量PCR儀檢測，當待測組的基因LIMG水平為正常參比組基因UMG水平的2 ± O. 05倍及以上時，判定為陽性；采用ELISA免疫檢測法檢測UMG編碼的蛋白時，當待測組的基因UMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因UMG水平的2±0. 05倍及以上時，判定為陽性。通過獲得足夠量的乳腺癌病例和正常例，用統(tǒng)計學95%可信區(qū)間的方法初步設定正常值范圍，從而在分子水平上實現(xiàn)乳腺癌的初步診斷。本發(fā)明的檢測方法簡便、快速，可作為大規(guī)模篩查使用，也可作為臨床上的檢測手段，為乳腺癌的檢測提供了一種新途徑。


圖I為UMG的基因結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為在大腸桿菌BL21中表達UMG-GST融合蛋白的電泳圖譜；圖3為用純化蛋白作為抗原制備的抗體，Western Blot法可以檢測過表達的LIMG ；圖4為乳腺腫瘤和遠端正常乳腺中LMG表達水平的比較；圖5為UMG在小鼠乳腺發(fā)育過程中的表達水平的變化。
具體實施例方式實施例I :LIMG抗體的制備利用BL21大腸桿菌細胞表達純化UMG-GST蛋白質(zhì)，用此蛋白制備了特異性UMG多克隆抗體及體外蛋白功能檢測首先采用PCR的方法擴增出LIMG片段，然后進行瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，再進行酶切及過夜連接，將LMG片段克隆至pGEX4T3質(zhì)粒，將UMG/pGEX4T3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21細胞中，采用經(jīng)典的IPTG誘導蛋白表達方法，誘導目的蛋白表達，之后裂解大腸桿菌用GST-beads純化UMG-GST融合蛋白。LIMG/pGEX4T3 質(zhì)粒合成方法pGEX_4T3購自AmershamBiosciences公司，根據(jù)LIMG全長基因序列，設計擴增LIMG截短的基因片段的特異引物。上游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 1所示，
下游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 2所示，SEQ NO ID :1 :5’ GACGCGTGGATCCCCTTTTCCTCCCTGTTGTCCC3’SEQ NO ID :2 :5’ GTCCGCCGAATTCGACCTTTTGTACAAAGAGGGCA3’誘導上游引物L5’端加了限制性內(nèi)切酶BamHI酶切位點，下游引物R5’端加入限制性內(nèi)切酶EcoRI酶切位點。用上述引物擴增出截短的UMG基因片段，取5μ I進行1%瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠上切下含有目的片段的凝膠，按照DNA凝膠純化試劑盒操作步驟純化回收目的片段。表達質(zhì)粒的構(gòu)建純化的目的基因片段，經(jīng)T4DNA連接酶與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒后，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切反應，回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶與經(jīng)同樣雙酶切的pGEX-4T3連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，提取質(zhì)粒后，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切鑒定，篩選出含目的基因片段的陽性克隆，并測序，得到陽性克隆即為目的質(zhì)粒。誘導目的蛋白表達的方法將含有目的基因重組表達質(zhì)粒UMG/pGEX4T3的BL21菌株，接種于含100 μ g/ml氨芐青霉素的2YT培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜后，按I : 100比例轉(zhuǎn)種于新鮮2YT培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加IPTG至終濃度為lmmol/L，誘導4 5h，取菌體用于SDS-PAGE分析。所得的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色后，推算的UMG分子量與UMG真核表達推算所得相一致，如圖2所示；圖2為在大腸桿菌BL21中表達UMG-GST融合蛋白，圖為經(jīng)考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE膠，圖中1-3列分別為IPTG(O. ImM)誘導2h，3h，4h后純化的LIMG-GST蛋白。第4列為蛋白marker。用該融合蛋白作為抗原免疫兔子,得到的免疫后血清用免疫熒光染色、WesternBlot, ELISA法可以檢測到內(nèi)源表達的UMG。多克隆抗體制備參考教科書《免疫學》，利迪亞德(Peter M Lydyard) AlexWhelan Michael W Fanger譯者林慰慈,魏雪濤,薛彬,2010年,科學出版社。所得的血清抗體可以識別外源表達的UMG蛋白，如圖3所示；圖3為western檢測抗體識別蛋白情況，圖為經(jīng)二抗孵育后的經(jīng)SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)膜后的圖，圖中上下兩幅分別代表使用血清抗體和FLAG標簽抗體識別外源UMG蛋白表達情況，從左至右分別為對照組(無外源蛋白表達)和實驗組(LIMG蛋白表達)。Western Blot法可以檢測到過表達的UMG，證明我們制備的抗體具有特異性。實施例2 :乳腺腫瘤UMG在人乳腺腫瘤中高表達我們檢測了正常乳腺細胞系和乳腺腫瘤細胞系中LIMG在RNA和蛋白水平的表達，發(fā)現(xiàn)LIMG在腫瘤細胞的表達均高于正常。我們通過提取24例病人的遠端正常組織及22例腫瘤組織的RNA進行RT-PCR檢測了其RNA水平的差異，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的病人腫瘤組織UMG的表達均高于正常。并且與腫瘤惡性程度分級相關。RNA水平檢測采用的是realtime PCR的方法，具體的RT-PCR的條件引物、體系、循環(huán)溫度和時間等如下上游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ NO ID 4所示；SEQ NO ID :3 :5’ CTTGTCCATTCTCAGCGACA 3’
SEQ NO ID 4 :5’ ACTCCCTCACACCACTGACC 3’反應體系購于TAKARA 公司SYBR Premix Ex Taq real-time 檢測試劑
權(quán)利要求
1.基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在診斷和/或治療乳腺癌中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選電泳法、免疫印跡法、雙抗體夾心法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，采用定量PCR法檢測基因LIMG的表達，用定量PCR儀檢測，當待測組的基因UMG水平為正常參比組基因UMG水平的2±0. 05倍及以上時，判定為陽性； 采用ELISA免疫檢測法檢測UMG編碼的蛋白時，當待測組的基因UMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因UMG水平的2±0. 05倍及以上時，判定為陽性。
4.一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒為定量PCR的試劑盒，包括提取DNA的試劑盒、正常參比組的DNA、UMG基因的引物。
5.一種用于診斷乳腺癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒采用免疫檢測法，包括提取蛋白質(zhì)的試劑盒、LMG抗體包被的孔板、LIMG的單克隆或多克隆抗體、作為濃度參比標準的UMG純化蛋白、第二抗體、ELISA顯色試劑，用于檢測的酶標儀，其中，UMG抗體為單抗或多抗。
6.基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述的基因LIMG在性激素及類似物的作用下增加表達。
8.基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在檢測乳腺發(fā)育中的應用。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于，所述的檢測方法包括定量PCR檢測法、免疫檢測法；其中，免疫檢測法優(yōu)選定量PCR、免疫印跡法、雙抗體夾心法。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體，具體講，涉及基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)及其抗體的在乳腺癌診斷和/或治療中的應用。當采用定量PCR法檢測基因LIMG的表達，用定量PCR儀檢測，當待測組的基因LIMG水平為正常參比組基因LIMG水平2±0.05倍及以上時，判定為陽性；采用ELISA免疫檢測法檢測LIMG編碼的蛋白時，當待測組的基因LIMG編碼的蛋白質(zhì)水平為正常參比組基因LIMG水平的2±0.05倍及以上時，判定為陽性。本發(fā)明還涉及基因LIMG、其編碼的蛋白質(zhì)及其抗體在豐乳中的應用，以及檢測乳腺發(fā)育中的應用。
文檔編號A61P35/00GK102952849SQ20111023760
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月18日
發(fā)明者李凌松 申請人:李凌松