專利名稱：一種燈盞細辛注射制劑的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種燈盞細辛注射制劑的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
心腦血管疾病一直困撓著西方發(fā)達國家，其死亡率位居各種疾病之首。據(jù)統(tǒng)計，美國心腦血管疾病死亡人數(shù)竟占到疾病死亡總?cè)藬?shù)的50％，成為威脅人類健康的第一殺手。近年來，隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展和人民生活水平的提高，冠心病、腦卒中、高血壓等心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率也直線上升。我國每年有250萬人死于心腦血管疾病，而且還以每年新發(fā)130-150萬例的速度在增長。燈盞細辛又名燈盞花、燈盞菊、土細辛、土朝陽、土頂草、土菊、雙葵花等，為菊科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.的全草。分布于我國云南、湖南、廣東、廣西、貴州、四川等地。性味甘溫，具有散寒解表，活血舒筋，擴張微細動脈，改善微循環(huán)，增加組織灌注量，降低血液粘滯度等功能。臨床用于治療高血壓、腦溢血、腦血栓形成、腦栓塞、冠心病、心絞痛等病癥具有特殊療效，尤其用于治療心腦血管缺血性疾病方面療效顯著，燈盞細辛已收入2005版《中華人民共和國藥典》第一部。
自20世紀70年代中期開始，國內(nèi)對燈盞細辛進行深入的化學(xué)成分研究，確定其中含有黃酮、吡喃酮、植物甾醇焦性兒茶酚等成分，云南藥物研究所的研究人員通過研究確認燈盞乙素為其主要的活性成分，并把含有少量燈盞甲素的混和物通稱為燈盞花素，化合物中燈盞乙素的含量在90％以上。燈盞花素因其確切的心腦血管方面的療效而被開發(fā)成片劑、膠囊、注射劑等多種劑型，在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。隨著對燈盞細辛研究的不斷深入，從中分離得到另外一類活性成分即咖啡酸奎寧酸酯化合物，該類化合物與活性成分燈盞乙素具有協(xié)同作用，可以增加燈盞花素心腦血管方面的活性。專利CN01115358.X公開了一種野黃芩苷和咖啡?？鼘幩岬乃幱媒M合物，該組合物從燈盞花提取制得時，僅通過水煎或酒精回流提取，提取液經(jīng)正丁醇萃取、干燥而得，該提取物因?qū)嵤┘夹g(shù)的限定，使得提取物含有很多植物來源的蛋白、粘液質(zhì)大分子雜質(zhì)，不適合制成注射制劑。專利CN03117754.9公開了“燈盞細辛酚及其制備方法和在制藥中的應(yīng)用”，其燈盞細辛有效部位燈盞細辛酚的制備方法，雖然用大孔樹脂進行分離，但是沒有對大孔樹脂優(yōu)選，同時應(yīng)用有機溶媒醋酸乙酯萃取提取總咖啡酸酯，該制備方法實用性不強，分離過程采用大量的有機試劑故不利于工業(yè)生產(chǎn)。
目前中藥制劑的應(yīng)用日益廣泛，人們普遍認為中藥藥性平和，副作用小，安全可靠，但隨著中藥新品種及新劑型的不斷出現(xiàn)，特別是中藥注射劑的廣泛應(yīng)用，不良反應(yīng)問題日益突出，其中熱原反應(yīng)和過敏反應(yīng)最為嚴重。中藥注射劑誘發(fā)過敏反應(yīng)的物質(zhì)很多，其中蛋白質(zhì)、多肽、多糖等大分子物質(zhì)為全抗原，對中藥注射劑的質(zhì)量影響最大，制備過程中應(yīng)采取有效措施去除這些物質(zhì)，以保證制劑的安全性，提高中藥注射劑的質(zhì)量。


發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，本發(fā)明研究人員經(jīng)過大量試驗研究，通過陶瓷膜超濾去除提取液中的蛋白質(zhì)、粘液質(zhì)等大分子過敏原和熱原物質(zhì)，進行有效成分的富集；再利用大孔樹脂吸附性和篩性的原理以及燈盞細辛中化學(xué)成分理化性質(zhì)的差異性，使燈盞細辛中含有的親水性成分黃酮苷燈盞乙素和咖啡酰類成分可以分別被有效的純化。因此本研究將回收乙醇后的水提取液通過陶瓷膜超濾去除植物性大分子物質(zhì)和熱原物質(zhì)，同時富集有效成分；超濾液經(jīng)過大孔樹脂柱，蒸餾水洗脫雜質(zhì)后，再用適當(dāng)溶劑進行梯度洗脫，從而達到分離、純化的目的。采用該工藝制備方法提取得到的燈盞細辛有效部位其總酚性物質(zhì)含量為70-90％，其中燈盞乙素含量為42-50％。采用本發(fā)明提取工藝制備的提取物有效成分含量高、溶解性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定。由該提取物制成的注射制劑安全性更好、刺激性小，質(zhì)量穩(wěn)定，能顯著提高散寒解表，活血化瘀等功效。
本發(fā)明旨在提供一種理化性質(zhì)穩(wěn)定、安全、適合大工業(yè)生產(chǎn)的燈盞細辛注射制劑。
本發(fā)明還提供了燈盞細辛注射制劑的制備方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn) 一、工藝制法 (1)燈盞細辛有效部位的制備 取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用6-8倍量的50-80％乙醇水溶液回流提取三次，每次1.5-3h。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用堿液調(diào)節(jié)pH值6.5-8.0，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值5.0-6.0，減壓濃縮至1-3g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用20-40％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至1.0-2.0，靜置12-30h，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶3-5次得精制燈盞乙素；再用40-70％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位； (2)制劑的制備 水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH值6.5-7.0，灌裝，滅菌，即得； 凍干粉針劑的制備取有效部位，加入凍干賦形劑，調(diào)pH值6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，即得； 輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，即得； 在本發(fā)明有效部位的制備工藝中，過濾優(yōu)選不低于300目的濾布。
在本發(fā)明中調(diào)節(jié)pH值的堿液優(yōu)選氫氧化鈉。
在本發(fā)明中超濾用陶瓷膜的截留分子量優(yōu)選1-3萬。
本發(fā)明燈盞細辛凍干粉針制劑的賦形劑為甘露醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖酐、葡聚糖中的一種或兩種。
二、優(yōu)選試驗 在本發(fā)明的制備工藝中，大孔吸附樹脂的種類和操作條件對產(chǎn)品質(zhì)量非常重要，因此，我們對大孔吸附樹脂進行了篩選，以確保燈盞細辛注射制劑的穩(wěn)定性和臨床療效；篩選試驗如下 1.樹脂型號的優(yōu)選 將樹脂首先進行預(yù)處理，進行低溫真空干燥，待用。精確稱取一定體積的燈盞細辛提取溶液，往溶液中加入定量的樹脂，充分攪拌，濾去樹脂得到濾液，濾液定容、稀釋，按照紫外分光光度法測定燈盞細辛有效部位的含量。已吸附飽和的樹脂，加入丙酮，充分解吸。
按照下面的公式計算 吸附率E＝(Co-Cr)/Co×100％ 樹脂在室溫下的吸附量Q＝(Co-Cr)×V/W 洗脫率＝(c1×v1)/{(Co-Cr)·V}×100％ 公式中Q為吸附量(mg/g)，Co為起始濃度(mg/mL)，Cr為剩余濃度(mg/mL)，V為吸附溶液體積(mL)，C1為洗脫濃度(mg/mL)，v1為洗脫液的體積，W為樹脂重量(g)；結(jié)果見表1。
表1不同樹脂對燈盞細辛有效部位的吸附性能的影響 試驗結(jié)果表明Hp-20、LD605相對D101比吸附值大，能負載成分多，SP207由于比表面積大，孔徑小，對成分吸附力強，相比來講，HP-20和LD605比較容易解吸附，所用洗脫劑量少，從節(jié)約角度看，選用HP-20和LD605大孔樹脂。
從試驗結(jié)果可見HP-20和LD605對燈盞細辛有效部位的富集效果要優(yōu)于其余二者，故選用HP-20和LD605為純化樹脂。
2.上樣濃度的優(yōu)選 藥液的濃度過大、粘度過稠都不利于大孔樹脂的充分吸附，藥液的濃度太低，會影響生產(chǎn)效率。取不同濃度的藥液，選用LD605作靜態(tài)吸附試驗；結(jié)果見表2。表2不同上樣濃度對燈盞細辛有效部位的吸附性能的影響 試驗結(jié)果表明隨著藥液濃度的增加，樹脂的吸附不易達到飽和，上樣藥液濃度達到2g/ml后，樹脂的吸附能力下降，為了保證產(chǎn)量，并節(jié)約能源，故藥液的上樣濃度優(yōu)選范圍為0.5-2g/ml。
3.最佳上柱量的優(yōu)選 分別吸取燈盞細辛有效部位(2g/ml，生藥)5ml、10ml、15ml、20ml、25ml上LD605型大孔樹脂柱(R15×H90mm樹脂干重50g)，過柱的流出液重復(fù)吸附三次，且靜置30min，依次用去離子水、60％的乙醇各100ml梯度洗脫，收集60％乙醇洗脫液，按測定方法，測定燈盞細辛有效部位的量；結(jié)果見表3。 表3不同上柱量對燈盞細辛有效部位的吸附性能的影響 試驗結(jié)果表明5ml、10ml、15ml、20ml、25ml通過大孔樹脂吸附柱后，60％乙醇洗脫液中燈盞細辛有效部位總量無明顯變化，而5ml燈盞細辛有效部位總量與10ml成比例關(guān)系，這說明，10ml為飽和的上柱量，因此10ml為最佳的上柱量。我們計算出大孔吸附樹脂柱色譜的理論上樣量為2kg(燈盞細辛藥材)/kg(樹脂干重)。為了使樹脂能達到良好的分離效果，考慮到燈盞細辛當(dāng)中含有的其它成分可能會影響大孔吸附樹脂的吸附量，我們最終確定的上樣量是1.0-2.0kg(燈盞細辛原藥材)/kg(樹脂干重)。
4.洗脫劑濃度的優(yōu)選 洗脫劑的選擇是色譜技術(shù)中實現(xiàn)有效分離的關(guān)鍵，大孔樹脂也不例外。大孔吸附樹脂柱色譜洗脫常用的溶劑系統(tǒng)有不同濃度的甲醇/水、乙醇/水或丙酮/水等，從安全性和生產(chǎn)成本等方面綜合考慮，我們選擇了乙醇/水，并著重考察了洗脫劑的濃度。樹脂柱在上樣后首先以去離子水沖洗，除去無機鹽、雜蛋白以及多糖等極性較大的不保留成分，水洗至洗脫液顏色變淺，洗脫液揮去溶媒后殘余物顯著減少，一般需要兩個柱床體積的去離子水沖洗；然后以一定濃度的乙醇溶液洗脫，由于咖啡酰類化合物的極性較黃酮苷類成分低，所以我們在考察洗脫溶媒的濃度時選擇以能將燈盞乙素大部份洗脫，而咖啡酰類成分未大量洗脫的濃度；進一步考察能將大部分咖啡酰類成分洗下的濃度。
試驗方法如下往玻璃層析柱(柱內(nèi)徑5mm；柱長70cm)中裝入200g(濕重)預(yù)處理完畢的LD605型大孔樹脂柱(以去離子水混懸后注入柱中)，然后加入相當(dāng)于300g燈盞細辛藥材的乙醇提取物，以去離子水開始洗脫，在洗脫約三個柱床體積(約900mL)后，水洗脫液顏色變淺，此時收集200mL洗脫液，減壓揮干后基本無殘余物，停止水洗脫；改用不同濃度的乙醇溶液洗脫，依次以0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的乙醇沖洗，每個濃度下洗脫600mL，分別收集后減壓揮干，HPLC檢查每段洗脫物的組成情況；結(jié)果見表4。
表4不同濃度洗脫液洗脫下各類成分的組成 +表示檢出目標(biāo)成分；-表示未檢出目標(biāo)成分 用十八烷基硅烷鍵合硅硅膠為填充劑；乙腈-0.2％磷酸(22∶68)為流動相；流速為1ml/min；柱溫40℃；VWD紫外檢測器，檢測波長為335nm。。從上表可以看出，30％的乙醇液已基本上可以將燈盞乙素洗脫，60％的乙醇液已基本上可以將咖啡酰類成分洗脫，因此我們最終選擇10-30％和40-60％的乙醇作為大孔吸附樹脂柱色譜的解吸附溶媒。
5.收集洗脫液量的優(yōu)選 考察方法與洗脫劑濃度的考察相似，往玻璃層析柱(柱內(nèi)徑60mm；柱長100cm)中裝入1kg預(yù)處理完畢的LD605型大孔樹脂，然后加入相當(dāng)于1.5kg燈盞細辛藥材的燈盞細辛乙醇提取物，以去離子水開始洗脫，在洗脫約三個柱床體積后，改用60-70％的乙醇洗脫，分別依次收集第1倍、第2倍和第3倍柱床體積的洗脫液，減壓回收，TLC檢測每段洗脫物中的成分的組成情況；結(jié)果見表5。 表5不同洗脫段下各類成分的組成 +表示檢出目標(biāo)成分；-表示未檢出目標(biāo)成分 試驗結(jié)果表明第3-5倍柱床體積的洗脫液已基本上將咖啡酰類物質(zhì)洗脫下，而且合并3-5段洗脫液，計算含量后得到的回收率已大于90％，因此我們最終確立大孔吸附樹脂柱色譜的解吸附溶媒量為3-5倍柱床體積。
6.調(diào)酸過程相關(guān)參數(shù)的優(yōu)選 結(jié)合燈盞乙素在酸性條件下易析出的特性，本研究選用濃鹽酸調(diào)PH值。主要考察以下幾個參數(shù)pH值、靜置時間、藥液的密度。
(1)pH值的優(yōu)選 調(diào)pH值前測樣品溶液的pH值為3.8-4.2，為了使溶液中燈盞乙素充分的析出，對pH值進行優(yōu)選試驗，結(jié)果見表6。 表6不同pH值對燈盞乙素提取率的影響 試驗結(jié)果表明在pH值在1.0-2.0之間時，燈盞乙素提取率最高，故pH值優(yōu)選范圍為1.0-2.0。
(2)靜置時間的優(yōu)選 將藥液調(diào)酸后，觀察上清液的澄清度，結(jié)果見表7。
表7靜置時間對藥液澄清度的影響 試驗結(jié)果表明在藥液靜置15-30h的時候，澄明度最好，故將藥液調(diào)酸后的靜置時間定為15-30h。
(3)藥液密度的優(yōu)選 藥液太濃，析出的沉淀夾雜的雜質(zhì)多，影響產(chǎn)品析出的純度；藥液太稀，不利于燈盞細辛有效部位的收率，損失多，因此必須尋找藥液調(diào)酸前的合適濃度，本發(fā)明研究人員對藥液密度進行優(yōu)選試驗，結(jié)果見表8。 表8不同藥液濃度對產(chǎn)品收率的影響 試驗結(jié)果表明，藥液的密度定為0.75-1.25g.ml-1時產(chǎn)品收率最高。
在本發(fā)明燈盞細辛有效部位的制備過程中，大孔吸附樹脂為現(xiàn)有大孔吸附樹脂，優(yōu)選HP-20型和LD-605型大孔吸附樹脂； 在本發(fā)明燈盞細辛有效部位的優(yōu)選試驗中，大孔吸附樹脂柱藥液的上樣濃度優(yōu)選范圍為0.5-2g生藥/ml； 在本發(fā)明燈盞細辛有效部位的優(yōu)選試驗中，大孔吸附樹脂柱的上樣量是1.0-2.0kg(燈盞細辛原藥材)/kg(樹脂干重)； 在本發(fā)明燈盞細辛有效部位的優(yōu)選試驗中，優(yōu)選10-40％的乙醇溶液富集燈盞乙素；40-70％的乙醇溶液作為解吸附溶媒富集咖啡酰類活性成分。收集10-40％的乙醇洗脫液，減壓回收溶劑至無醇味，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值為1.0-2.0，使燈盞乙素充分結(jié)晶析出，通過重結(jié)晶可以得到較純的燈盞乙素；合并純化的燈盞乙素和40-70％的乙醇洗脫的富含咖啡酰類化合物的部分，干燥，既得到本發(fā)明的燈盞細辛有效部位； 本發(fā)明還提供了一種燈盞細辛有效部位，該有效部位是用上述制備方法制得，經(jīng)檢測，該有效部位提取物中燈盞乙素含量42％-50％，優(yōu)選含量為45％以上；該有效部位提取物中總酚性物質(zhì)的含量70％-90％，優(yōu)選含量為80％以上； 本發(fā)明還提供了燈盞細辛有效部位的含量測定方法，其中燈盞乙素采用HPLC法測定，總酚性物質(zhì)采用紫外可見分光光度法測定； 本發(fā)明中燈盞乙素的含量采用HPLC法測定，具體操作步驟為 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.2％磷酸溶液(22∶78)為流動相；檢測波長334nm。理論板數(shù)按野黃芩苷計算應(yīng)不低于2500； 對照品溶液的制備精密稱取燈盞乙素對照品適量置量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液； 供試品溶液的制備精密稱提取物適量置量瓶中，用50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得； 測定法分別精密吸取對照品與供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得； 本發(fā)明中總酚性物質(zhì)采用紫外可見分光光度法測定，具體操作步驟為 對照品溶液的制備；精密稱取4，5-氧-二咖啡?？鼘幩徇m量置量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得； 供試品溶液的制備精密稱取提取物適量置量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。
測定法分別取對照品溶液與供試品溶液，照紫外-可見分光光度法(附錄VA)，在332nm處測定吸光度，計算，即得； 三、藥理毒理試驗 試藥與動物燈盞細辛注射液(市售品)；本發(fā)明燈盞細辛注射制劑(按本發(fā)明制備工藝制備，由北京聯(lián)合偉華藥業(yè)中藥實驗室提供)；Wistar大鼠，體重180-220g；健康昆明種小鼠，體重20-24g； 1.對小鼠缺氧耐力的影響實驗 實驗方法取健康昆明種小鼠50只，體重20-24g。隨機分成對照組，燈盞細辛注射液組、本發(fā)明燈盞細辛注射制劑組。每組10只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。以人常規(guī)治療劑量折算為小鼠的劑量。折算公式為待測動物試用劑量＝已知動物給藥量×待測動物的體表面積比值/已知動物的體表面積比值。對照組給生理鹽水，1次/天，連續(xù)7d。于末次給藥后1h，將小鼠分別置于體積為150ml磨口瓶中，內(nèi)放15g鈉石灰，密閉觀察其存活時間；結(jié)果見表9。表9對小鼠常壓缺氧的影響(X±SD) 注與對照組比較*P＜0.01；與燈盞細辛注射制劑組比較#P＜0.05。
實驗結(jié)果表明本發(fā)明注射制劑、燈盞細辛注射液均能提高小鼠常壓缺氧耐力，平均存活時間比對照組顯著延長；本發(fā)明注射制劑和燈盞細辛注射液相比，平均存活時間也有差異。說明本發(fā)明注射制劑的作用強于燈盞細辛注射液。
2.對小鼠心肌缺氧的保護作用實驗 實驗方法取健康昆明種小鼠50只，體重20-24g，隨機分成5組，隨機分成對照組，燈盞細辛注射液組、本發(fā)明制劑組。每組雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。以人常規(guī)治療劑量折算為小鼠的劑量。折算公式為待測動物試用劑量＝已知動物給藥量×待測動物的體表面積比值/已知動物的體表面積比值。對照組給生理鹽水。給藥方法1次/天，連續(xù)6天。于末次給藥后1小時用烏拉坦1.2g/kg腹腔注射麻醉，背部固定，分離氣管，以動脈夾夾閉氣管，用心電儀觀察心電，并用秒表記下小鼠夾閉氣管后至心電消失的時間；結(jié)果見表10。 表10對小鼠心肌缺氧的影響(X±SD) 注與對照組比較*P＜0.01；與燈盞細辛注射液比較#P＜0.05 實驗結(jié)果表明本發(fā)明注射制劑、燈盞細辛注射液均能對小鼠心肌缺氧起保護作用，平均存活時間比對照組顯著延長；本發(fā)明注射制劑和燈盞細辛注射液相比，平均存活時間也有差異。說明本發(fā)明注射制劑的作用強于燈盞細辛注射液。
3.對大鼠體內(nèi)血栓形成的影響 取Wistar大鼠50只，體重180-220g，隨機分成5組，每組10只，分別為生理鹽水對照組、燈盞細辛注射液組、本發(fā)明注射制劑組。以人常規(guī)治療劑量折算為大鼠的劑量。折算公式為待測動物試用劑量＝已知動物給藥量×待測動物的體表面積比值/已知動物的體表面積比值。將各組動物給藥(生理鹽水組給予等體積的生理鹽水)，每日1次，連續(xù)給藥7天，末次給藥后1小時，將大鼠用10％水合氯醛，按0.3g/kg體重麻醉后固定，分離左頸總動脈，在血栓儀上以2mA電流刺激血管7min后，記錄血栓形成時間；結(jié)果見表11。
表11對大鼠體內(nèi)血栓形成的影響(X±SD) 注與對照組比較*P＜0.01；與燈盞細辛注射液組比較#P＜0.05 實驗結(jié)果表明本發(fā)明注射制劑和燈盞細辛注射液都能延長大鼠體內(nèi)血栓的形成；本發(fā)明注射制劑和燈盞細辛注射液相比，延長時間也有差異。說明本發(fā)明注射制劑的作用強于燈盞細辛注射液。
4.抗血小板聚集作用 取Wistar大鼠50只，體重180-220g，隨機分成5組，每組10只，分別為對照組、燈盞細辛注射液組、本發(fā)明注射制劑組。以人常規(guī)治療劑量折算為大鼠的劑量。折算公式為待測動物試用劑量＝已知動物給藥量×待測動物的體表面積比值/已知動物的體表面積比值。各組動物給藥，每日1次，連續(xù)給藥7天，末次給藥后1小時，動物麻醉后自腹主動脈取血，抗凝劑采用3.28％枸櫞酸鈉，與血液以1∶9比例混合。將抗凝全血在20℃條件下1500r·min-1離心5min，獲得富血小板血漿(platelet-richplasma，PRP)。留取定量PRP后，將剩余PRP再次以3000r·min-1離心10min，獲得自身對照貧血小板血漿(platelet-poorplasma，PPP)。以PPP調(diào)節(jié)PRP濃度，使各PRP濃度相同。將PRP在37℃的恒溫孔中預(yù)熱后，加入ADP(終濃度為3μmol·L-1)引起血小板聚集，記錄最大聚集率；結(jié)果見表12。表12抗血小板聚集作用(X±SD) 注與對照組比較*P＜0.01；與燈盞細辛注射液組比較#P＜0.05 實驗結(jié)果表明本發(fā)明注射制劑和燈盞細辛注射液都能明顯抑制血小板聚集，但是本發(fā)明注射制劑抑制血小板聚集的作用強于燈盞細辛注射液。
5.血管刺激性考察 取家兔8只，隨機均分2組，每組4只，分別于左耳把家兔置于固定器中，且頭用兔頭固定儀固定，用酒精將皮膚消毒后，于右側(cè)耳緣靜脈注射燈盞細辛注射液和本發(fā)明注射制劑，給藥劑量相當(dāng)于生藥2.0g/kg，于另一側(cè)對應(yīng)部位注射同一體積的生理鹽水作為對照，每日注射1次，連續(xù)1周，觀察兔耳緣靜脈反應(yīng)，每日觀察注射部位血管有無發(fā)紅、水腫、周圍有無滲血，觸摸血管有無變硬現(xiàn)象，左右耳比較觀察。于末次給藥后24h，將動物處死，取下兩耳，進行組織切片檢查，切片部位為進針部位的向心端，距進針部位1-4cm，分1-2.5cm和2.5-4cm兩段取樣。
觀察指標(biāo)及評分標(biāo)準(zhǔn)觀察方法包括肉眼觀察和顯微鏡下病理觀察。觀察給藥血管及其周圍組織的變化，顯微鏡下觀察耳緣靜脈有無血栓形成、內(nèi)皮損傷及血管周圍組織的病理變化情況。對各項指標(biāo)評分。①血管變化肉眼觀察無明顯充血記0分，輕度充血發(fā)紅、紋路清晰記1分，充血發(fā)紅、紋路不清記2分，重度充血、呈紫紅色記3分；顯微鏡觀察血管內(nèi)皮及血管壁完整記0分，有內(nèi)皮損傷記1分，有血栓栓塞記2分，血管破裂記3分。②血管周圍組織變化肉眼觀察無明顯水腫記0分，輕微水腫記1分，明顯水腫記2分，嚴重水腫記3分；顯微鏡觀察周圍組織正常記0分，水腫記1分，出血記2分，有炎癥細胞浸潤記3分。將每組4只家兔各項觀察指標(biāo)得分累加，計算各組平均得分值，見表13。
表13刺激性試驗結(jié)果 由以上實驗結(jié)果可知本發(fā)明注射制劑與燈盞細辛注射液比較刺激性具有明顯改善。
6.溶血毒性考察 2％紅細胞混懸液的制備取兔耳緣靜脈取血10-20ml，放入盛有玻璃珠的錐形瓶中，振搖10分鐘，除去纖維蛋白原，使成脫纖血。加10倍量的生理鹽水溶液，搖勻，離心，除去上清液，沉淀的紅細胞再用生理鹽水溶液洗滌2-3次，至上清液不呈紅色時為止。將所得的紅細胞用用生理鹽水配成濃度為2％的混懸液，即得。
試驗方法取試管6支，按表中的配比量依次加入2％紅細胞混懸液和生理鹽水溶液，混勻，于37℃恒溫箱中放置30分鐘，分別加入不同量的藥液(以第6管為空白對照)，搖勻后，置37℃恒溫箱中，開始每隔15分鐘觀察1次，1小時后，每隔1小時觀察1次，共觀察2小時。結(jié)果見表14。
表14溶血實驗結(jié)果 結(jié)果以第3試管為準(zhǔn)，各管均未染有紅色，顯微鏡下觀察未見有紅細胞破裂，說明本品不溶血，安全性好。
7.急性毒性試驗 取Wistar大鼠80只，雌雄各半。禁食24h，隨機分4組，每組20只。濃縮成相同的生藥濃度，各組分別尾靜脈注射藥物，給藥劑量按生藥量折算相當(dāng)于2.0？g生藥/kg，每天給藥3次，連續(xù)7天，觀察小鼠死亡情況，結(jié)果見表15。
表15急性毒性實驗結(jié)果 急性毒性實驗結(jié)果表明本發(fā)明注射制劑與燈盞細辛注射液比較安全性更好。
四、制備實施例 實施例1 (1)燈盞細辛有效部位的制備 取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用6倍量的50％乙醇水溶液回流提取三次，每次1.5h。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值6.5，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值5.0，減壓濃縮至1g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用20％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至1.0，靜置12h，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶3次得精制燈盞乙素；再用40％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位； (2)制劑的制備 水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH6.5-7.0，灌裝，滅菌，制備成本發(fā)明水針制劑1000支； 凍干粉針劑的制備取有效部位，加入甘露醇，調(diào)pH6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，制備本成發(fā)明凍干粉針制劑1000支； 輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，制備成本發(fā)明輸液劑500瓶； 實施例2 (1)燈盞細辛有效部位的制備 取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用7倍量的55％乙醇水溶液回流提取三次，每次2h。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值6.8，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值5.5，減壓濃縮至1.5g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用25％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至1.5，靜置15h，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶4次得精制燈盞乙素；再用50％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位； (2)制劑的制備 水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH6.5-7.0，灌裝，滅菌，制備成本發(fā)明水針制劑1000支； 凍干粉針劑的制備取有效部位，加入葡萄糖，調(diào)pH6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，即得制備本成發(fā)明凍干粉針制劑1000支； 輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，制備成本發(fā)明輸液劑500瓶； 實施例3 (1)燈盞細辛有效部位的制備 取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用8倍量的60％乙醇水溶液回流提取三次，每次2.5h。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值7.0，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值6.0，減壓濃縮至2.5g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用30％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至2.0，靜置18h，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶5次得精制燈盞乙素；再用50％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位； (2)制劑的制備 水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH6.5-7.0，灌裝，滅菌，制備成本發(fā)明水針制劑1000支； 凍干粉針劑的制備取有效部位，加入乳糖和右旋糖酐，調(diào)pH6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，制備成本發(fā)明凍干粉針制劑1000支； 輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，制備成本發(fā)明輸液劑500瓶； 實施例4 (1)燈盞細辛有效部位的制備 取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用6倍量的65％乙醇水溶液回流提取三次，每次3h。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值8.0，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值6.0，減壓濃縮至3g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用40％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至1.8，靜置24h，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶3次得精制燈盞乙素；再用55％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位； (2)制劑的制備 水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH6.5-7.0，灌裝，滅菌，即得制備成本發(fā)明水針制劑1000支； 凍干粉針劑的制備取有效部位，加入葡聚糖，調(diào)pH6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，制備本成發(fā)明凍干粉針制劑1000支；； 輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，制備成本發(fā)明輸液劑500瓶； 實施例5 (1)燈盞細辛有效部位的制備 取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用7倍量的70％乙醇水溶液回流提取三次，每次1.5h。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用碳酸鈉調(diào)節(jié)pH值6.8，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值5.4，減壓濃縮至2.5g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用30％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至1.8，靜置30h，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶4次得精制燈盞乙素；再用60％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位； (2)制劑的制備 水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH6.5-7.0，灌裝，滅菌，制備成本發(fā)明水針制劑1000支； 凍干粉針劑的制備取有效部位，加入甘露醇和葡萄糖，調(diào)pH6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，制備本成發(fā)明凍干粉針制劑1000支；； 輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，制備成本發(fā)明輸液劑500瓶； 實施例6 (1)燈盞細辛有效部位的制備 取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用8倍量的75％乙醇水溶液回流提取三次，每次2h。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值7.5，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值5.8，減壓濃縮至2.4g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用38％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至1.6，靜置20h，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶4次得精制燈盞乙素；再用60％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位； (2)制劑的制備 水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH6.5-7.0，灌裝，滅菌，制備成本發(fā)明水針制劑1000支； 凍干粉針劑的制備取有效部位，加入葡萄糖和乳糖，調(diào)pH6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，制備本成發(fā)明凍干粉針制劑1000支； 輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，制備成本發(fā)明輸液劑500瓶。
權(quán)利要求
1.一種燈盞細辛注射制劑，其特征在于燈盞細辛有效部位中總酚性物質(zhì)的含量為70％-90％，其中燈盞乙素的含量為42％-50％；
2.如權(quán)利要求1所述的燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征包括以下步驟
(1)燈盞細辛有效部位的制備
取燈盞細辛的全草，粉碎成粗粉，藥材用6-8倍量的50-80％乙醇水溶液回流提取三次，每次1.5-3小時。過濾，棄渣，合并提取液，藥液減壓回收乙醇至無醇味，回收液用堿液調(diào)節(jié)pH值6.5-8.0，過陶瓷膜超濾，除去植物性大分子雜質(zhì)；超濾液用鹽酸調(diào)pH值5.0-6.0，減壓濃縮至1-3g/ml，濃縮液上大孔樹脂層析，先用水洗脫，再用20-40％乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，用濃鹽酸調(diào)pH值至1.0-2.0，靜置12-30小時，離心，沉淀物用乙醇重結(jié)晶3-5次得精制燈盞乙素；再用40-70％乙醇洗脫大孔吸附樹脂柱，收集乙醇洗脫液，減壓揮去溶媒，得濃縮液；將濃縮液和燈盞乙素合并，得燈盞細辛有效部位；
(2)制劑的制備
水針劑的制備取有效部位，加入注射用水，用0.1％的活性碳煮沸15min，趁熱濾過，濾液繼續(xù)用0.22μm的微孔濾膜濾過，調(diào)pH值6.5-7.0，灌裝，滅菌，即得；
凍干粉針劑的制備取有效部位，加入凍干賦形劑，調(diào)pH值6.5-7.0，濾過，濾液加0.1％的活性碳煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋，即得；
輸液劑的制備取有效部位，加入適量吐溫-80，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，即得；
3.如權(quán)利要求1所述的燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征在于所述陶瓷膜超率的截留分子量為8000千至3萬；
4.如權(quán)利要求1所述的燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂為HP-20型和LD605型樹脂；
5.如權(quán)利要求1所述的燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂上樣濃度0.5-2g/ml；最佳上樣量是1.0-2.0kg(燈盞細辛原藥材)/kg(樹脂干重)；
6.如權(quán)利要求1所述的一種燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征在于所述的最終選擇10-30％和40-60％的乙醇作為大孔吸附樹脂柱色譜的解吸附溶媒；
7.如權(quán)利要求1所述的一種燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征在于所述的最終確立大孔吸附樹脂柱色譜的解吸附溶媒量為3-5倍柱床體積；
8.如權(quán)利要求1所述的一種燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征在于所述的靜置時間定為15-30小時；
9.如權(quán)利要求1所述的一種燈盞細辛注射制劑的制備方法，其特征在于所述的藥液的密度定為0.75-1.25g.ml-1；
10.如權(quán)利要求1所述的一種燈盞細辛注射制劑，其特征在于在制備治療心腦血管疾病藥物中的應(yīng)用；
全文摘要
本發(fā)明公開了一種燈盞細辛注射制劑的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明的特點是采用陶瓷膜超濾除去植物性大分子雜質(zhì)，并根據(jù)大孔樹脂吸附性和篩性的原理以及燈盞細辛中化學(xué)成分理化性質(zhì)的差異性，對燈盞細辛中的有效成分黃酮苷燈盞乙素和咖啡酰類成分進行有效的富集，從而達到分離、純化的目的。采用該工藝制備方法提取得到的燈盞細辛有效部位其總酚性物質(zhì)含量為70％－90％，其中燈盞乙素含量為42％－50％。由本發(fā)明所研制的燈盞細辛注射制劑安全性更好、刺激性小，能顯著提高散寒解表，活血舒筋等功效。本發(fā)明制劑在治療心腦血管缺血性疾病方面療效顯著。
文檔編號A61P9/00GK1947736SQ200510112608
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者張樹祥, 闞迎昕 申請人:北京聯(lián)合偉華藥業(yè)有限公司