專利名稱：一種促進(jìn)gp96蛋白的免疫活性的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促進(jìn)gp96蛋白的免疫活性的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)具有獨(dú)特的免疫學(xué)功能，其免疫學(xué)機(jī)制包括二方面一是HSI^s參與T細(xì)胞抗原呈遞；二是HSI^s有效激發(fā)天然免疫。熱休克蛋白存在于細(xì)胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)，由多個(gè)成員組成，如HSP60，HSP70，HSP90 和gp96等。熱休克蛋白一方面作為分子伴侶在蛋白折疊與運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用 ’另一方面能結(jié)合細(xì)胞中5-25mer的抗原多肽，通過(guò)抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面CD91分子進(jìn)入細(xì)胞并將結(jié)合的抗原表位呈遞給MHC I類和II類分子，從而啟動(dòng)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。熱休克蛋白本身是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的天然佐劑，它可作用于APC及T細(xì)胞等其它免疫細(xì)胞，促進(jìn)DC成熟，刺激細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子IL-6、IL-12、 TNF等，從而增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)。有研究表明gp96對(duì)于APC中Tol 1樣受體 (Toll-likereceptors,TLRs)發(fā)揮免疫學(xué)功能起至關(guān)重要的作用，gp96基因缺失的DC細(xì)胞中TLRs喪失引發(fā)天然免疫的功能，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠抵抗感染的能力明顯降低。熱休克蛋白-多肽復(fù)合物治療性疫苗已用于臨床試驗(yàn)。由于腫瘤細(xì)胞是一種變異的細(xì)胞，因此外源性地給予非特異性或特異性免疫因子或細(xì)胞，增強(qiáng)或擴(kuò)大機(jī)體的免疫力， 可達(dá)到清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的目的?；谶@個(gè)原理，多種非特異性免疫學(xué)治療方法如給予外源性白介素2、干擾素、LAK細(xì)胞的輸注等方法均已在臨床使用，但療效并不令人滿意，主要原因之一是存在腫瘤免疫逃逸。腫瘤細(xì)胞常常丟失腫瘤抗原的表達(dá)或改變其抗原表達(dá)譜， 使得針對(duì)已知腫瘤抗原而設(shè)計(jì)的腫瘤疫苗不能有效激發(fā)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。研究表明腫瘤具有個(gè)體特異性，腫瘤的特異性不僅表現(xiàn)在腫瘤類型之間，還表現(xiàn)在不同個(gè)體之間， 即同種類型腫瘤患者中，不同個(gè)體的腫瘤生物學(xué)和免疫學(xué)特性也存在顯著差別。HSP天然結(jié)合腫瘤細(xì)胞中各種抗原，因此將熱休克蛋白開(kāi)發(fā)成個(gè)體化腫瘤疫苗，可以充分考慮到患者個(gè)體間的差異，以達(dá)到最佳治療效果。開(kāi)展個(gè)體化治療亦是當(dāng)今醫(yī)學(xué)及藥物學(xué)發(fā)展的必然方向之一。近6年來(lái)，HSP gp96-多肽復(fù)合物用于臨床試驗(yàn)相繼在美國(guó)、英國(guó)、德國(guó)、意大利及俄羅斯等國(guó)的醫(yī)院或癌癥中心進(jìn)行，主要用于胃癌、前列腺癌、腎癌，黑色素瘤等腫瘤和 HIV、生殖器泡疹等傳染性疾病的治療。目前腎癌和惡性黑色素瘤的治療已完成臨床III 期，直腸癌和淋巴瘤已完成臨床II期。該治療方法在俄羅斯已經(jīng)批準(zhǔn)上市。從已有的臨床資料看，gp96-抗原復(fù)合物作為自體疫苗治療腫瘤療效無(wú)容置疑，腎細(xì)胞癌和黑色素瘤已經(jīng)完成III期臨床，接受治療的患者數(shù)量大，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Mla和Mlb期患者接受10次以上的免疫，平均存活期比醫(yī)生選擇的治療延長(zhǎng)18. 4個(gè)月(31.2vs 12. 8月，P = 0.03，危險(xiǎn)比HR = 0. 45)。對(duì)未轉(zhuǎn)移腎癌患者治療的III期臨床資料發(fā)現(xiàn)中等風(fēng)險(xiǎn)患者(n = 362) (包括Ι/ΙΙ期，III期的Τ1/2/3)接受gp96自體疫苗治療，復(fù)發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)45% (P <0.01， 危險(xiǎn)比HR = 0. 55)，與對(duì)照相比復(fù)發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)約1.8年，同時(shí)接受治療的患者存活期延長(zhǎng)。
調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)抑制了很多類型細(xì)胞的活化、增值、分化和效應(yīng)功能，包括 ⑶4+、⑶8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞及DC細(xì)胞。Treg是一類⑶4+CD25+的T細(xì)胞。 Treg分為兩個(gè)主要類群胸腺衍生的天然Treg(IiTreg)和外周誘導(dǎo)的Treg(iTreg)。它們通過(guò)不同的途徑來(lái)行使抑制調(diào)節(jié)功能，nTreg主要通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用，而 iTreg通過(guò)高濃度的TGFi3 1或者IL_10/TGFi3 1發(fā)揮抑制功能。去除Treg細(xì)胞導(dǎo)致小鼠自發(fā)的產(chǎn)生自身免疫疾病。但也有證據(jù)表明，去除或者減少Treg細(xì)胞能增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)病毒、 腫瘤等疾病的免疫反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進(jìn)gp96蛋白的免疫活性的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了免疫調(diào)節(jié)劑在提高gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)的免疫活性中的應(yīng)用；所述 gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至 355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物。本發(fā)明還保護(hù)一種疫苗佐劑，為如下(a)或(b)或(c) :(a)由免疫調(diào)節(jié)劑和所述 N355片段組成的疫苗佐劑；(b)由免疫調(diào)節(jié)劑和所述gp96蛋白組成的疫苗佐劑；(c)由免疫調(diào)節(jié)劑和所述含有g(shù)p96蛋白的提取物組成的疫苗佐劑。本發(fā)明還保護(hù)一種乙肝疫苗和/或抑制乙肝病毒的疫苗，由所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)、乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心蛋白(HBcAg)和免疫調(diào)節(jié)劑組成。本發(fā)明還保護(hù)一種乙肝疫苗和/或抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)、 乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫調(diào)節(jié)劑組成；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。本發(fā)明還保護(hù)一種黑色素瘤疫苗，由所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)劑組成。以上任一所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種。所述Foxp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。以上任一所述含有g(shù)p96蛋白的提取物是將離體動(dòng)物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細(xì)胞的勻漿液依次進(jìn)行ConA-S印harose層析和HiTrap-Q Sepharose離子交換層析得到的；所述離體動(dòng)物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤(pán)；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞IfepG2或黑色素瘤細(xì)胞B16 ；所述ConA-S^harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為 0. 25ml/min ； (2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為0. 5ml/ min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟 (PMSF)至終濃度為ImM ； (3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0. 25ml/min，收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為 200mMpH7. 5的PBS中加α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為 ImM ；所述HiTrap-Q kpharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min ； (b)用5ml NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ； (c)用IOml NaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱， 流速為lml/min ； (d)用:3ml NaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min，得到的洗脫液即為含有g(shù)p96蛋白的提取物。以上任一所述疫苗的各個(gè)組分均單獨(dú)包裝。gp96蛋白既可天然提取，也可利用大腸桿菌或酵母表達(dá)。gp96蛋白、N355片段和含有g(shù)p96蛋白的提取物與乙肝抗原表位免疫小鼠可明顯提高iTreg的數(shù)量，同時(shí)Treg的功能也明顯增強(qiáng)，包括對(duì)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制和分泌IFN- γ的抑制功能明顯增強(qiáng)，Treg與⑶8+T、乙肝抗原特異性T細(xì)胞、分泌IFN- γ細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Treg對(duì)T細(xì)胞有抑制作用。gp96蛋白一方面通過(guò)抗原呈遞激活CTL，同時(shí)又能激活Treg，Treg反過(guò)來(lái)又抑制CTL活性，因此gp96對(duì)乙肝T細(xì)胞免疫有雙向調(diào)節(jié)功能。在上述免疫中加入免疫調(diào)節(jié)劑，可清除gp96誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，T細(xì)胞數(shù)量有明顯提高，包括⑶8+T、乙肝抗原特異性T細(xì)胞、分泌IFN-γ細(xì)胞數(shù)量有明顯增加(P <0.01)，說(shuō)明免疫調(diào)節(jié)劑可顯著增強(qiáng)gp96引發(fā)的乙肝特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。小鼠試驗(yàn)表明，本發(fā)明提供的乙肝疫苗能有效激活HBV特異性T細(xì)胞，小鼠免疫8周后血清中的HBV S抗原降低 50%以上，肝臟細(xì)胞中病毒清除90%以上。以上研究表明疫苗有良好的抗HBV活性。給小鼠注射低劑量的環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體或下調(diào)R)xp3等抑制Treg，則疫苗對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制能顯著提高(P < 0. 01)。將gp96與小鼠黑色素瘤抗原體外組裝，制備gp96腫瘤疫苗。通過(guò)不同劑量的小鼠免疫試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)高劑量的gp96疫苗引發(fā)的對(duì)黑色素瘤的免疫排斥反應(yīng)反而低于低劑量組。研究闡明了 gp96免疫調(diào)控機(jī)制，一方面通過(guò)抗原呈遞激活CTL 殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)又能激活iTreg抑制CTL活性，降低腫瘤免疫排斥反應(yīng)。在gp96腫瘤疫苗免疫實(shí)驗(yàn)中同時(shí)注射低劑量的環(huán)磷酰胺，清除gp96誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，則顯著提高gp96腫瘤疫苗的活性。上述實(shí)驗(yàn)中，使用抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA(siRNA)同樣能降低 Treg的數(shù)量，達(dá)到增強(qiáng)gp96疫苗免疫活性的目的。


圖1為N355片段的鑒定圖譜。圖2為rgp96蛋白的鑒定圖譜；1 分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 步驟(二)的發(fā)酵液；3 親和層析后的洗脫液；4 離子交換層析后的洗脫液；5 :rgp96蛋白的western blot。圖3為gp96提取物的鑒定圖譜。圖4為實(shí)施例2中rgp96蛋白和gp96提取物的免疫活性比較(流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果)；A 為 HBc87-95，B 為 HBc87_95+gp96，C 為 HBc87_95+rgp96，D 為 HBc87_95+IFA。圖5為實(shí)施例4中T細(xì)胞活性檢測(cè)和Tetramer檢測(cè)的結(jié)果；A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(免疫引發(fā)的乙肝病毒特異性CTL反應(yīng))，B為CD8+T細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例(免疫引發(fā)的T細(xì)胞反應(yīng))，C為Tetramer陽(yáng)性細(xì)胞占⑶8+T細(xì)胞的比例(免疫引發(fā)的乙肝特異性T 細(xì)胞反應(yīng))；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。圖6為復(fù)合物免疫的ELISP0T檢測(cè)結(jié)果。圖7為實(shí)施例4中Treg檢測(cè)結(jié)果；A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(免疫引發(fā)的乙肝病毒特異性CTL反應(yīng))，B為Treg陽(yáng)性細(xì)胞占⑶4+T細(xì)胞的比例；1為第一組，2為第二組，3 為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。圖8為免疫對(duì)小鼠Treg活性的促進(jìn)；A =FACS檢測(cè)Treg對(duì)⑶4和⑶8T細(xì)胞增殖的抑制；B 第一組、第二組和第五組免疫對(duì)⑶4和⑶8T細(xì)胞增殖的抑制作用；C 第三組、第四組和第六組免疫對(duì)⑶4和⑶8T細(xì)胞增殖的抑制作用；D 第一組、第二組和第五組免疫對(duì)分泌IFN-Y的細(xì)胞的抑制作用；E 第三組、第四組和第六組免疫對(duì)分泌IFN-Y的細(xì)胞的抑制作用；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。圖9為免疫小鼠中Treg與T細(xì)胞的相關(guān)性分析；A =Treg與總CD8+細(xì)胞；B =Treg 與乙肝特異性T細(xì)胞；C =Treg與分泌IFN- γ的T細(xì)胞。圖10為實(shí)施例5的步驟一的1的結(jié)果。圖11為實(shí)施例5的步驟一的2的結(jié)果。圖12為實(shí)施例5的步驟二的結(jié)果。圖13為實(shí)施例5的步驟三的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華公司；HBV轉(zhuǎn)基因鼠購(gòu)自廣州解放軍第458醫(yī)院。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。以下實(shí)施例中均采用皮下注射進(jìn)行免疫(實(shí)際應(yīng)用中，也可隨機(jī)選用其它免疫方式， 如皮內(nèi)注射或肌肉注射)。乙肝表面抗原(HBsAg)購(gòu)自北京天壇生物股份公司。乙肝核心蛋白(HBcAg)購(gòu)自abeam公司，產(chǎn)品編號(hào)ab49013?？笴D4的抗體購(gòu)自BioLegend， 產(chǎn)品目錄號(hào)100407?？笴D8的抗體購(gòu)自BioLegend，產(chǎn)品目錄號(hào)100705。抗CD25的抗體購(gòu)自BioLegend，產(chǎn)品編號(hào)101906。抗R)xP3的抗體購(gòu)自eBioscience，產(chǎn)品目錄號(hào) 77-5775。HBc87-95 是乙肝核心蛋白表位87-95，序列為SYVNTNMGL，由上海吉爾生化公司合成。HBsAg362-371 是乙肝表面抗原表位362-371，序列為WYWGPSLYSI，由上海吉爾生化公司合成。乙肝聚合酶表位140-148，序列為HYFQTRHYL，由上海吉爾生化公司合成。轉(zhuǎn)錄因子R)xP3是特異的Treg細(xì)胞的分子標(biāo)志，對(duì)⑶4+CD25+Treg細(xì)胞的發(fā)育和行使功能有著重要的作用；FoxP3的干擾RNA :5’-GGACACUCAAUGAAAUCUA-3’，由廣州銳博公司合成。gp96 蛋白(人熱休克蛋白；GENBANK ACCESSION NO. AY040226)的氨基酸序列如序列表的序列1 所示，其編碼序列如序列表的序列2所示。gp96蛋白片段(N355片段)為序列表的序列1 自氨基末端第1至355位氨基酸殘基組成的多肽，其編碼序列如序列表的序列2自5’末端第1至1065位核苷酸所示。實(shí)施例1、N355片段、gp96蛋白和gp96蛋白的提取物的制備一、N355片段的制備利用大腸桿菌表達(dá)N355片段，具體方法如下1、設(shè)計(jì)如下N355引物對(duì)，由上海英俊公司合成引物上游引物5，-CGCGGATCCGACGATGAAGTTGATGTGGAT-3，；下游引物5，-CCGCTCGAGTTAAGTAAAGTGAATATAAGCCATG-3，。2、提取人肝癌細(xì)胞H印G2(購(gòu)自ATCC，產(chǎn)品號(hào)HB-8065)的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。3、以步驟2的cDNA為模板，用N355引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(含 N355片段的編碼序列)。4、用限制性內(nèi)切酶BarnHI和Bio I雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。
5、用限制性內(nèi)切酶BarnHI和Xho I雙酶切pGEX_6P_l質(zhì)粒(購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品編號(hào)27-4597-01)，回收載體骨架。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到連接產(chǎn)物。7、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (購(gòu)自天根生化科技公司，產(chǎn)品號(hào)CB101-03)感受態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定陽(yáng)性的菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒PGEX-N355 (骨架載體為pGEX_6P_l，在BarnHI和Bio I酶切位點(diǎn)之間插入了 N355片段的編碼序列)。8、將重組質(zhì)粒pGEX-N355轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)(購(gòu)自天根生化科技公司，產(chǎn)品號(hào)CB105-(^)感受態(tài)細(xì)胞，從平板上挑取單菌落接入含lOOmg/mL氨芐青霉素的2 X YT培養(yǎng)基(胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化鈉5g，加水定容至IOOOmL)活化；取活化液(菌液) 接入2 X YT培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至OD6tltl值為0. 6-1. 0，然后加入IPTG (使其終濃度為lmmol/ L)，37°C誘導(dǎo)4h，收集菌體。9、菌體用 PBS 緩沖液(140mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4 1. 8mmo VLKH2PO4 ；pH 7. 3)重懸，冰浴條件下超聲破碎Q00W，破碎如停6s，99次3個(gè)循環(huán))，然后40C 12000轉(zhuǎn)/min離心20min,收集上清。10、將上清4 °C進(jìn)行親和層析，載體為Glutathione-kpharose 4B (購(gòu)自GE 公司，產(chǎn)品編號(hào)17-5132-01)，采用還原型谷胱甘肽洗脫緩沖液(lOmmol/L reduced glutathione, 50mmol/L Tris-HCl, pH8. 0)洗脫，收集洗脫液。11、將洗脫液用超濾濃縮法更換成酶切緩沖體系(50mmol/L Tri s-HCl, pH8. 0 ； 150mmol/LNaCl ；lmmol/L DTT ；lmmol/L EDTA，pH 8· 0)，加入過(guò)量PreScission Protease酶 (PSP蛋白；購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品編號(hào)27-0843-01)，4°C酶切16h。12、將酶切后的酶切體系用超濾濃縮法更換成PBS緩沖液，然后進(jìn)行親和層析，載體為Glutathione-kpharose 4B，采用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，GST和PSP結(jié)合到層析柱上， 收集洗脫液，即為N355片段。13、將含有N355片段的溶液進(jìn)行10% SDS-PAGE，然后進(jìn)行考染，見(jiàn)圖1的泳道1。 N355片段的純度達(dá)95%以上。將N355片段進(jìn)行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體 (購(gòu)自santacruz，產(chǎn)品號(hào)sc-56399)，見(jiàn)圖1的泳道2。二、重組gp96蛋白(rgp96蛋白)的制備( 一 )重組質(zhì)粒 pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96 的構(gòu)建1、提取人肝癌細(xì)胞H印G2的mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。2、以步驟1的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。上游引物5，-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3，；下游引物5，-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3，。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BioI雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切質(zhì)粒pHFMDZ-RIA (購(gòu)自hvitrogen公司， 產(chǎn)品號(hào)V20520)，回收載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pHFMDZ-Rl_gp96。測(cè)序結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pHFMDZ-Rl-gp96的骨架載體為pHFMDZ-RIA，在EcoRI和 XhoI酶切位點(diǎn)之間插入了 gp96蛋白的編碼序列)。
6、在重組質(zhì)粒pHFMDZ-Rl-gp96的BglII酶切位點(diǎn)插入LEU2片段(序列表的序列 3所示的DNA)，BamHI酶切位點(diǎn)插入α -淀粉酶報(bào)告系統(tǒng)(序列表的序列4所示的DNA)，得到重組質(zhì)粒 pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96。(二)rgp96蛋白的表達(dá)1、采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pHFMDZ-RlL2GAmy-gp96導(dǎo)入漢遜酵母(購(gòu)自ATCC，產(chǎn)品號(hào)MYA-335)細(xì)胞，得到重組菌。2、將重組菌接種于5mL SD液體培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司，產(chǎn)品號(hào) GMS12117. 7)，37°C培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)接到IOOmL SYN6培養(yǎng)基(購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥公司， 產(chǎn)品號(hào)GMS12116. 1)，30°C培養(yǎng)48h，得到種子培養(yǎng)液。3、將兩瓶種子培養(yǎng)液接種于含有2L SYN6培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，30°C培養(yǎng)；使用氨水控制pH維持在5. 5 ；每4h檢測(cè)1次發(fā)酵液中甘油含量，根據(jù)發(fā)酵液中甘油的濃度補(bǔ)加甘油，控制甘油終濃度在0. 5%左右，同時(shí)控制溶氧在20%以上；根據(jù)菌體的生成情況檢測(cè)菌體濕重，等菌體濕重達(dá)到180-200g/L的時(shí)候停止補(bǔ)加甘油，開(kāi)始誘導(dǎo)重組rgp96蛋白產(chǎn)生(補(bǔ)加甲醇，使甲醇濃度維持在0. 5-0. 8%左右)，誘導(dǎo)開(kāi)始72小時(shí)后停止發(fā)酵。(三)rgp96蛋白的分離純化將步驟(二)的發(fā)酵液離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，在球磨機(jī) (DYNO-MILLmodel KDL)中，按照廠家提供的操作手冊(cè)使用玻璃珠球磨的方法破碎細(xì)胞；破碎后的細(xì)胞12000轉(zhuǎn)/min離心20min，收集上清液；上清液用0. 45 μ m濾膜進(jìn)行過(guò)濾，得到濾液，將濾液進(jìn)行濃縮，得到濃縮液。將濾液進(jìn)行親和層析，具體步驟如下采用英俊公司anvitrogen Corporation) 的Ni-NTAPurification System進(jìn)行親和層析，主要步驟為先用PBS平衡柱子池；然后用 PBS (含20mM咪唑)平衡柱子池；將濃縮液用PBS (含20mM咪唑)稀釋后上樣；用PBS (含 20mM咪唑)沖洗柱子至OD值< 0. 01 ；用PBS (含200mM咪唑)洗脫1. 5h，收集洗脫液(即為rgp96蛋白)；所有操作在4C下進(jìn)行，流速為0. 5mL/min。每升步驟(二)的發(fā)酵液純化后可以獲得50毫克純度90%以上的rgp96蛋白。 如果蛋白洗脫液中含有異源雜蛋白，可將親和層析的洗脫液進(jìn)行離子交換層析⑴柱)，主要步驟200mMNaCl的PBS液平衡；上樣；300mM NaCl的PBS液洗雜質(zhì)；800mM NaCl的PBS 液洗目的蛋白。將步驟(二)的發(fā)酵液、親和層析后的洗脫液(rgp96蛋白)和離子交換層析后的洗脫液進(jìn)行10% SDS-PAGE，然后進(jìn)行考染，見(jiàn)圖2。rgp96蛋白的純度達(dá)90%以上。將rgp96 蛋白進(jìn)行western blot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購(gòu)自santa cruz，產(chǎn)品號(hào)sc-56399)，見(jiàn)圖2。三、gp96提取物的制備用小鼠肝臟制備gp96提取物，方法如下1、組織勻漿勻漿緩沖液配方在pH7. 0的碳酸氫鈉緩沖液中加PMSF(苯甲基磺酰氟，分子式為 C7H7FO2S)至終濃度ImM(置于冰上的燒杯中配置；PMSF在水溶液中數(shù)小時(shí)內(nèi)分解，該溶液不可過(guò)夜)。取燒杯置于冰上，將BALB/c小鼠肝組織在燒杯中迅速用剪刀剪成直徑約1_2毫米的碎塊，然后加入組織8倍重量的勻漿緩沖液；將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上；勻漿液倒入離心管，50，OOOg離心60min，取上清加入 1/10 體積的 10XPBS(pH7. 5，200mM NaCl)，用于步驟 2 的 ConA-kpharose 層析。2>ConA-Sepharose MiiT載體為ConA-S印harose (購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品號(hào)17-0440-01)，按“ Iml載體/4g組織”計(jì)算使用量。層析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是1. 6X2. 5cm。將上清用蠕動(dòng)泵上樣，0. 25ml/min。在PBS (ρΗ7· 5，200mM NaCl)中加PMSF至終濃度ImM，作為洗脫液甲；用蠕動(dòng)泵將10倍柱體積的洗脫液甲過(guò)層析柱(0. 5ml/min)，以去除未結(jié)合蛋白。在PBS (pH7. 5，200mM NaCl)中加α-D-卩比喃葡萄糖至終濃度10% (10g/mL)，加 PMSF至終濃度ImM，作為洗脫液乙；用蠕動(dòng)泵將3倍柱體積的洗脫液乙過(guò)層析柱(0. 25ml/ min)，收集洗脫液。3、HiTrap-Q kpharose 離子交換層析載體為HiTrap-Q Sepharose (層析柱為HiTrap Q HP ；購(gòu)自GE公司，產(chǎn)品號(hào) 17-1153-01)。層析柱的內(nèi)徑和柱長(zhǎng)是0. 7X2. 5cm。將載體裝柱后，先用5ml PBS (pH7. 5，200mM NaCl)清洗(lml/min)。將步驟2的洗脫液上樣(lml/min)；然后將5ml PBS (pH7. 5, 200mM NaCl)過(guò)層析柱(lml/min)，以去除未結(jié)合蛋白；然后將10ml PBS (pH7. 5，300mM NaCl)過(guò)層析柱(lml/min)，以去除未結(jié)合蛋白； 然后將:3ml PBS (pH7. 5，600mM NaCl)過(guò)層析柱(lml/min)，收集洗脫液，即為gp96提取物。將gp96提取物進(jìn)行10% SDS-PAGE，然后考染，見(jiàn)圖3的泳道1。將gp96提取物進(jìn)行westernblot，一抗為大鼠抗gp96抗體(購(gòu)自santa cruz，產(chǎn)品號(hào)sc-56399)，見(jiàn)圖3的泳道2。除了小鼠肝臟，也可用如下組織中制備gp96提取物小鼠黑色素瘤(B16)、豬肝臟、人肝癌細(xì)胞系HepG2培養(yǎng)細(xì)胞、臨床手術(shù)切除的人腫瘤組織(乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、 腸癌、肝癌、胃癌)和人胎盤(pán)；提取方法參照小鼠肝臟的提取。實(shí)施例2、rgp96蛋白和gp96提取物免疫活性比較將BALB/c小鼠隨機(jī)分成四組，每組10只，分別進(jìn)行如下免疫(免疫體積相等)第一組(HBc87_95)用HBc87_95 免疫小鼠，50 微克 / 次；第二組(HBc87-95+gp96)用實(shí)施例1的步驟三制備的gp96提取物和HBc87_95 — 起免疫小鼠，gp96提取物20微克/次，HBc87-9550微克/次；第三組(HBc87-95+rgp96)用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 — 起免疫小鼠，rgp96蛋白20微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組(HBc87_95+IFA)用弗氏不完全佐劑和HBc87_95—起免疫小鼠，弗氏不完全佐劑20微克/次，HBc87-9550微克/次。在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞活性(采用FITC標(biāo)記的抗⑶8的抗體和PE標(biāo)記的Pentamer)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4(上)。⑶8和 Pentamer-PE雙陽(yáng)性細(xì)胞即為HBc87_95肽特異性CD8+T細(xì)胞，計(jì)算其占CD8+T細(xì)胞的百分比，見(jiàn)圖4(下)。rgp96蛋白和gp96提取物免疫均可顯著提高T細(xì)胞反應(yīng)，rgp96蛋白和 gp96提取物免疫引發(fā)的CLT沒(méi)有明顯區(qū)別(P >0.01)；第二組和第三組的乙肝特異性CTL 數(shù)量顯著高于第一組(P < 0. 01)，也高于第四組。
實(shí)施例3、攜帶有g(shù)p96基因的表達(dá)載體與gp96提取物的免疫活性比較將gp96蛋白的編碼序列插入表達(dá)載體pCDNA3. 1 (購(gòu)自hvitrogen公司，產(chǎn)品編號(hào)V790-20) m EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒。將BALB/c小鼠隨機(jī)分成五組，每組10只，分別進(jìn)行如下免疫(免疫體積相等)第一組用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次；第二組用重組質(zhì)粒和HBc87_95 —起免疫小鼠，重組質(zhì)粒20微克/次， HBc87-9550 微克 / 次；第三組用重組質(zhì)粒和HBc87_95 —起免疫小鼠，重組質(zhì)粒50微克/次， HBc87-9550 微克 / 次；第四組用重組質(zhì)粒和HBc87_95 —起免疫小鼠，重組質(zhì)粒500微克/次， HBc87-9550 微克 / 次；第五組(HBc87-95+gp96)用實(shí)施例1的步驟三制備的gp96提取物和HBc87_95 — 起免疫小鼠，gp96提取物20微克/次，HBc87-9550微克/次。在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞活性。重組質(zhì)粒免疫可顯著提高T細(xì)胞反應(yīng)，相對(duì)于第一組，乙肝特異性CTL數(shù)量有顯著升高(P <0.01)。重組質(zhì)粒與gp96提取物免疫引發(fā)的CLT沒(méi)有明顯區(qū)別(P > 0. 01)。實(shí)施例4、rgp96蛋白或N355片段對(duì)免疫的雙向調(diào)節(jié)6-8周齡BALB/c小鼠分成五組，每組10只，分別免疫(免疫體積相等)如下第一組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第三組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第五組用HBc87_95免疫小鼠，50微克/次；第六組用HBc87-95免疫小鼠，50微克/次。在1、2、3周各免疫一次，在第4周，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞活性(采用FITC標(biāo)記的抗⑶8的抗體和Tetrame)，并進(jìn)行ELISP0T檢測(cè)和Treg檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)見(jiàn)圖5A， ⑶8陽(yáng)性細(xì)胞占脾細(xì)胞的比例見(jiàn)圖5B，Tetrame陽(yáng)性細(xì)胞占⑶8陽(yáng)性細(xì)胞的比例見(jiàn)圖5C。 ELISP0T檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。Treg檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。rgp96蛋白或N355片段免疫可顯著提高T細(xì)胞反應(yīng)；相對(duì)于第五組和第六組，總T細(xì)胞和乙肝特異性CTL數(shù)量有顯著升高(P < 0. 01)； rgp96蛋白或N355片段免疫可顯著提高乙肝病毒特異性CTL細(xì)胞活性(P < 0. 01)；高劑量免疫對(duì)病毒特異性T細(xì)胞和總T細(xì)胞的激活明顯低于低劑量組。rgp96明顯提高Treg 的數(shù)量，與對(duì)照相比，rgp96低劑量免疫或高劑量免疫Treg分別增加了 13. 86%或26. 70% (P < 0. 05或0. 01)，N355低劑量免疫和高劑量免疫Treg分別增加了 8. 77%或12. 54%, (P < 0. 05)。免疫對(duì)小鼠Treg活性的促進(jìn)見(jiàn)圖8，包括對(duì)⑶4+和⑶8+T細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制 (P < 0. 05或0. 01)和分泌IFN- γ的抑制(P < 0. 05或0. 01)功能明顯增強(qiáng)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)rgp96蛋白或N355片段免疫的小鼠中Treg與T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(見(jiàn)圖9)，Treg與總 CD8+T 細(xì)胞(r = 0. 84，P < 0. 01)、乙肝特異性 CTL (r = 0. 94，P < 0. 01)和分泌 IFN- γ 的 ⑶8+Τ細(xì)胞(r = 0. 79，P < 0. 01)均呈顯著負(fù)相關(guān)。綜上所述，rgp96蛋白或N355片段的免疫調(diào)控機(jī)制如下(1)通過(guò)抗原呈遞激活CTL ； (2)激活Treg，Treg反過(guò)來(lái)又抑制CTL活性。因此gp96蛋白(或其片段)對(duì)乙肝T細(xì)胞免疫有雙向調(diào)節(jié)功能，如何控制平衡點(diǎn)對(duì)于提高gp96免疫活性有重要意義。實(shí)施例5、免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)rgp96蛋白或N355片段免疫活性的促進(jìn)作用一、環(huán)磷酰胺對(duì)rgp96蛋白或N355片段的免疫活性的促進(jìn)作用1、高劑量免疫6-8周齡BALB/c小鼠分成六組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第三組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87_9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第五組用HBc87-95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次；第六組用HBc87-95和環(huán)磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，HBc87_9550微克/次，環(huán)
磷酰胺0. 4毫克/次。在1、2、3周各免疫一次，第4周用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(采用PE標(biāo)記的抗⑶25的抗體和APC標(biāo)記的抗R)xP3的抗體)。結(jié)果見(jiàn)圖10 ；A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果；B為環(huán)磷酰胺對(duì)Treg的數(shù)量的抑制作用(⑶25和R)xP3雙陽(yáng)性細(xì)胞占⑶4陽(yáng)性細(xì)胞的百分比)；C為環(huán)磷酰胺對(duì)CD8+細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用(CD8陽(yáng)性細(xì)胞占脾細(xì)胞的百分比)；D為環(huán)磷酰胺對(duì)乙肝特異性T細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用(Tetrame陽(yáng)性細(xì)胞占CD8陽(yáng)性細(xì)胞的百分比)；E為環(huán)磷酰胺對(duì)分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用(IFN-Y陽(yáng)性細(xì)胞占CD8陽(yáng)性細(xì)胞的百分比)；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。環(huán)磷酰胺可以有效去除HBc87-95和高劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，T細(xì)胞數(shù)量、 乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN- γ的T細(xì)胞數(shù)量有明顯提高，聯(lián)合使用環(huán)磷酰胺可使總T細(xì)胞、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN-Y的T細(xì)胞數(shù)量分別增長(zhǎng)21. 72%,52. 99%和63. 88% (P < 0. 05 或 0. 01)。2、低劑量免疫 6-8周齡BALB/c小鼠分成六組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第三組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小
13鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫 BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次；第五組用HBc87_95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次；第六組用HBc87_95和環(huán)磷酰胺一起免疫BALB/c小鼠，HBc87_9550微克/次，環(huán)
磷酰胺0. 4毫克/次。在1、2、3周各免疫一次。第4周用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖11 ；A為環(huán)磷酰胺對(duì)CD8+細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用(CD8陽(yáng)性細(xì)胞占脾細(xì)胞的百分比)；B為環(huán)磷酰胺對(duì)乙肝特異性T細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用(Tetrame陽(yáng)性細(xì)胞占CD8陽(yáng)性細(xì)胞的百分比)；C為環(huán)磷酰胺的分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量的促進(jìn)作用(IFN-Y陽(yáng)性細(xì)胞占⑶8陽(yáng)性細(xì)胞的百分比)；1為第一組，2為第二組，3為第三組，4為第四組，5為第五組，6為第六組。環(huán)磷酰胺可以有效去除HBc87-95和低劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，T細(xì)胞數(shù)量、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN- γ的T細(xì)胞數(shù)量有明顯提高(P < 0. 05)。rgp96蛋白(或N355片段)和環(huán)磷酰胺混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355片段)對(duì)T細(xì)胞的活化能力(P < 0. 05 或 0. 01)。二、抗⑶25的抗體對(duì)rgp96蛋白或N355片段的免疫活性的促進(jìn)作用6-8周齡BALB/c小鼠分成九組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗體30微克 /次；第三組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87_9550微克/次，抗CD25的抗體30微克/ 次；第五組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第六組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87_9550微克/次，抗CD25的抗體30微克 /次；第七組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第八組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和抗⑶25的抗體一起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次，抗CD25的抗體30微克 /次；第九組用HBc87_95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次。在1、2、3周各免疫一次；第4周用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(采用PE標(biāo)記的抗⑶25的抗體和FITC標(biāo)記的抗CD4的抗體)?？耿?5的抗體可以有效去除HBc87_95和高劑量rgp96 蛋白(或N355片段)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，T細(xì)胞數(shù)量、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN-γ的 T細(xì)胞數(shù)量有明顯提高；聯(lián)合使用抗CD25的抗體可使總T細(xì)胞、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌 IFN-Y的T細(xì)胞數(shù)量分別增長(zhǎng)31. 52%，63. 79%和75. 75% (P < 0. 05或0. 01)。使用抗 CD25的抗體有效去除HBc87-95和低劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，T 細(xì)胞數(shù)量、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN- γ的T細(xì)胞數(shù)量有明顯提高(P < 0. 05) ；rgp96 蛋白(或N355片段)和抗⑶25的抗體混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355片段) 對(duì)T細(xì)胞的活化能力(P < 0. 05或0. 01)。第一組和第二組的結(jié)果見(jiàn)圖12 ；A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，B為抗CD25的抗體對(duì)Treg的數(shù)量的抑制作用(CD25陽(yáng)性細(xì)胞占CD4陽(yáng)性細(xì)胞的百分比)。⑶25抗體處理可明顯清除Treg，使Treg數(shù)量降低了 9. 2倍，差異極顯著(P < 0. 01)。三、FoxP3的干擾RNA對(duì)gp96蛋白免疫活性的促進(jìn)作用6-8周齡BALB/c小鼠分成九組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87-9550微克/次；第二組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和R)xP3的干擾RNA 一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白10微克/次，HBc87_95 50微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500微克/次；第三組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87-9550微克/次；第四組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和R)XP3的干擾RNA — 起免疫BALB/c小鼠，N355片段10微克/次，HBc87_9550微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500 微克/次；第五組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87-9550微克/次；第六組用實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、HBc87_95和R)xP3的干擾RNA 一起免疫BALB/c小鼠，rgp96蛋白100微克/次，HBc87_9550微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500微克/次；第七組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段和HBc87_95 —起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87-9550微克/次；第八組用實(shí)施例1的步驟一制備的N355片段、HBc87_95和R)xP3的干擾RNA — 起免疫BALB/c小鼠，N355片段100微克/次，HBc87_9550微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500 微克/次；第九組用HBc87-95 免疫 BALB/c 小鼠，HBc87_9550 微克 / 次。在1、2、3周各免疫一次；第4周用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(采用PE標(biāo)記的抗⑶25的抗體和APC標(biāo)記的抗R)xP3的抗體)。FoxP3的干擾RNA可以有效去除HBc87_95和高劑量 rgp96蛋白(或N355片段)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Treg，T細(xì)胞數(shù)量、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN-γ 的T細(xì)胞數(shù)量有明顯提高；聯(lián)合使用R)xP3的干擾RNA可使總T細(xì)胞、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN-Y的T細(xì)胞數(shù)量分別增長(zhǎng)11. 63%,42. 67%和55. 57% (P < 0. 05或0. 01)。使用R)xP3的干擾RNA有效去除HBc87-95和低劑量rgp96蛋白(或N355片段)誘導(dǎo)產(chǎn)生的 Treg，T細(xì)胞數(shù)量、乙肝特異性T細(xì)胞和分泌IFN-γ的T細(xì)胞數(shù)量有明顯提高(P < 0. 05)； rgp96蛋白(或N355片段)和R)xP3的干擾RNA混合使用，能有效提高rgp96蛋白(或N355 片段)對(duì)T細(xì)胞的活化能力(P < 0. 05或0. 01)。第一組和第二組的結(jié)果見(jiàn)圖13 ；A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，B為R)xP3的干擾RNA對(duì)Treg的數(shù)量的抑制作用。FoxP3的干擾RNA處理可明顯清除Treg，抑制Treg的數(shù)量，使Treg數(shù)量降低了 7. 5倍，差異極顯著(P < 0. 01)。實(shí)施例6、乙肝蛋白疫苗的制備和效果評(píng)價(jià)一、乙肝蛋白疫苗甲的組成和效果評(píng)價(jià)1、乙肝蛋白疫苗甲的組成乙肝蛋白疫苗甲由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)和環(huán)磷酰胺組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝蛋白疫苗甲的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備將實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心蛋白(HBcAg)進(jìn)行體外組裝，得到疫苗前體。組裝體系的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下20mM HEPES (pH7. 2), 20mM NaCl,2mM MgCl2, IOOmM KCl, ImM PMSF, 2ug/ul rgp96 蛋白，lug/ul HBsAg，lug/ulHBcAg ；組裝條件45°C 10 分鐘(也可采用 45°C 10-30 分鐘，或 4°C 30-120 分鐘)。穩(wěn)定性-80°C保存，6個(gè)月后SDS凝膠電泳未見(jiàn)明顯降解或形成多聚物。(2)分組給藥8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和0. 4毫克環(huán)磷酰胺混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)。血清中HBsAg含量采用ELISA檢測(cè)(乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒，購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司)。肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例采用免疫組化檢測(cè)(抗體為 HBcAg兔多抗，購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，產(chǎn)品號(hào)CWP196)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D 值0.66士0.13)明顯小于第二組小鼠(1.21 士0.23)，二者差異達(dá)到顯著水平(P < 0. 05)。 第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(9% 士2)明顯小于第二組小鼠(20% 士3)，二者差異達(dá)到顯著水平(P < 0. 05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提高。二、乙肝蛋白疫苗乙的組成和效果評(píng)價(jià)1、乙肝蛋白疫苗乙的組成乙肝蛋白疫苗乙由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝蛋白疫苗乙的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥
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8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)。血清中HBsiVg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例的檢測(cè)方法同步驟一的2的⑵。 第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.60士0. 11)明顯小于第二組小鼠(1.30士0.25)，二者差異達(dá)到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(8% 士3)明顯小于第二組小鼠(18% 士幻，二者差異達(dá)到顯著水平(P<0. 05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中， 由于添加了 CD25抗體，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提高。三、乙肝蛋白疫苗丙的組成和效果評(píng)價(jià)1、乙肝蛋白疫苗丙的組成乙肝蛋白疫苗丙由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)和R)xP3的干擾RNA組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝蛋白疫苗丙的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和500微克R)xP3的干擾RNA混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)。血清中HBsiVg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例的檢測(cè)方法同步驟一的2的⑵。 第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.80士0. 11)明顯小于第二組小鼠(1.30士0.25)，二者差異達(dá)到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(10% 士3) 明顯小于第二組小鼠(18% 士幻，二者差異達(dá)到顯著水平(P <0.05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了 FoxP3的干擾RNA，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提高。四、乙肝蛋白疫苗丁的組成和效果評(píng)價(jià)1、乙肝蛋白疫苗丁的組成乙肝蛋白疫苗丁由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原(HBsAg)、 乙肝核心蛋白(HBcAg)、環(huán)磷酰胺和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝蛋白疫苗丁的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體、0. 4毫克環(huán)磷酰胺和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsiVg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)。血清中HBsiVg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例的檢測(cè)方法同步驟一的2的(2)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0. 46 士 0. 14)明顯小于第二組小鼠 (1. 25士0. 20)，二者差異達(dá)到顯著水平(P < 0. 05)。第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(5% 士2)明顯小于第二組小鼠(20% 士2)，二者差異達(dá)到顯著水平(P <0.05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺和抗CD25的抗體，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提高。與未附加免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行給藥的HBV轉(zhuǎn)基因鼠相比，上述四種疫苗均引起HBV轉(zhuǎn)基因鼠血清中的HBsAg抗原降低50%以上，肝臟細(xì)胞中病毒清除70-80%以上(HBcAg轉(zhuǎn)陰)， 差異均達(dá)到極顯著(P <0.01)。以上研究表明本發(fā)明的疫苗有良好的抗HBV活性。實(shí)施例7、乙肝表位疫苗的組成和效果評(píng)價(jià)
一、乙肝表位疫苗甲的組成和效果評(píng)價(jià)1、乙肝表位疫苗甲的組成乙肝表位疫苗甲由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和環(huán)磷酰胺組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝表位疫苗甲的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備將實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95和乙肝聚合酶表位140-148進(jìn)行體外組裝，得到乙肝蛋白疫苗前體。組裝體系的溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下20mM HEPES (pH7. 2), 20mM NaCl,2mM MgCl2, IOOmM KCl, ImMPMSF, 2ug/ul rgp96蛋白，上述三種表位各:3ug/ul ；組裝條件45°C 10分鐘(也可采用 45 0C 10-30 分鐘，或 4°C 30-120 分鐘)。穩(wěn)定性-80°C保存，6個(gè)月后SDS凝膠電泳未見(jiàn)明顯降解或形成多聚物。(2)分組給藥8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和0. 4毫克環(huán)磷酰胺混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg 的表達(dá)。血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例的檢測(cè)方法同實(shí)施例6的步驟一的2的O)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.62 士 0. 11)明顯小于第二組小鼠 (1. 11 士0.20)，二者差異達(dá)到顯著水平(P <0.05)。第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(8% 士2)明顯小于第二組小鼠(19% 士2)，二者差異達(dá)到顯著水平(P <0.05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提高。二、乙肝表位疫苗乙的組成和效果評(píng)價(jià)1、乙肝表位疫苗乙的組成乙肝表位疫苗乙由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和抗CD25的抗體組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝表位疫苗乙的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備
同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg 的表達(dá)。血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例的檢測(cè)方法同實(shí)施例6的步驟一的2的(2)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.09)明顯小于第二組小鼠 (1. 19士0. 18)，二者差異達(dá)到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(7% 士3)明顯小于第二組小鼠(17% 士2)，二者差異達(dá)到顯著水平(P <0.05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了 CD25抗體，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提高。三、乙肝表位疫苗丙的組成和效果評(píng)價(jià)1、乙肝表位疫苗丙的組成乙肝表位疫苗丙由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和R)xP3的干擾RNA組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝表位疫苗丙的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組10微升疫苗前體和500微克R)xP3的干擾RNA混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg 的表達(dá)。血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例的檢測(cè)方法同實(shí)施例6的步驟一的2的O)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.90 士 0.08)明顯小于第二組小鼠 (1. 30士0. 25)，二者差異達(dá)到極顯著水平(P < 0. 01)。第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(12% 士3)明顯小于第二組小鼠(18% 士3)，二者差異達(dá)到顯著水平(P <0.05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了 FoxP3的干擾RNA，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提高。四、乙肝表位疫苗丁的組成和效果評(píng)價(jià)
1、乙肝表位疫苗丁的組成乙肝表位疫苗丁由實(shí)施例1的步驟二制備的rgp96蛋白、乙肝表面抗原表位 362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148、環(huán)磷酰胺和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨(dú)包裝。2、乙肝蛋白疫苗丁的效果評(píng)價(jià)(1)疫苗前體的制備同步驟一的2的(1)。(2)分組給藥8周齡HBV轉(zhuǎn)基因鼠分成兩組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下
第一組10微升疫苗前體、0. 4毫克環(huán)磷酰胺和30微克抗⑶25的抗體混合，作為單次免疫劑量；第二組每次免疫10微升疫苗前體。在1、2、3周各免疫一次；8周后檢測(cè)小鼠血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg 的表達(dá)。血清中HBsAg含量和肝臟細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例的檢測(cè)方法同實(shí)施例6的步驟一的2的O)。第一組小鼠血清中HBsAg含量(0D值0.41 士 0. 13)明顯小于第二組小鼠 (1. 02士0. 19)，二者差異達(dá)到顯著水平(P < 0. 05)。第一組小鼠肝細(xì)胞中HBcAg的表達(dá)比例(5% 士2)明顯小于第二組小鼠(19% 士3)，二者差異達(dá)到顯著水平(P <0.05)。說(shuō)明本發(fā)明的疫苗中，由于添加了環(huán)磷酰胺和抗CD25的抗體，對(duì)乙肝病毒復(fù)制的抑制作用顯著提尚。與未附加免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行給藥的HBV轉(zhuǎn)基因鼠相比，上述四種疫苗均引起HBV轉(zhuǎn)基因鼠血清中的HBsAg抗原降低60%以上，肝臟細(xì)胞中病毒清除80-90%以上(HBcAg轉(zhuǎn)陰)，差異均達(dá)到極顯著(P<0.01)。以上研究表明本發(fā)明的疫苗有良好的抗HBV活性。實(shí)施例8、黑色素瘤疫苗的組成和效果評(píng)價(jià)一、gp96提取物的制備用黑色素瘤細(xì)胞B16(購(gòu)自ATCC，產(chǎn)品號(hào)CRL-6470制備gp96提取物，方法如下1、組織勻漿培養(yǎng)黑色素瘤細(xì)胞B16，收集細(xì)胞，加入組織8倍重量的勻漿緩沖液；將組織碎塊攪勻倒入玻璃勻漿器，勻漿至底部組織塊消失后再上下勻漿15次以上；勻漿液倒入離心管，50，OOOg離心60min，取上清加入1/10體積的10XPBS(pH7. 5,200mM NaCl)，用于步驟2 的 ConA-Sepharose 層析。2>ConA-Sepharose MiiT同實(shí)施例1的步驟三的2。3、HiTrap-Q kpharose 離子交換層析同實(shí)施例1的步驟三的3。二、黑色素瘤疫苗的組成黑色素瘤疫苗甲由步驟一制備的gp96提取物和環(huán)磷酰胺組成，各組分單獨(dú)包裝。黑色素瘤疫苗乙由步驟一制備的gp96提取物和抗⑶25的抗體組成，各組分單獨(dú)包裝。黑色素瘤疫苗丙由步驟一制備的gp96提取物和R)xP3的干擾RNA組成，各組分單獨(dú)包裝。三、分組免疫C57BL/6J小鼠(6_8周齡，購(gòu)自北京維通利華公司，品系C57BL/6J))分成四組，每組10只，分別免疫(體積相等)如下第一組每只皮下注射5X IO4個(gè)黑色素瘤細(xì)胞B16 ；10天后開(kāi)始免疫，每次同時(shí)免疫黑色素瘤疫苗甲的兩個(gè)組分，gp96提取物20微克/次，環(huán)磷酰胺0. 4毫克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第二組每只皮下注射5X IO4個(gè)黑色素瘤細(xì)胞B16 ；10天后開(kāi)始免疫，每次同時(shí)免疫黑色素瘤疫苗乙的兩個(gè)組分，gp96提取物20微克/次，抗⑶25的抗體30微克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第三組每只皮下注射5X IO4個(gè)黑色素瘤細(xì)胞B16 ；10天后開(kāi)始免疫，每次同時(shí)免疫黑色素瘤疫苗丙的兩個(gè)組分，gp96提取物20微克/次，F(xiàn)oxP3的干擾RNA 500微克/次， 每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第四組每只皮下注射5 X IO4個(gè)黑色素瘤細(xì)胞B16 ； 10天后開(kāi)始免疫，每次免疫步驟一制備的gp96提取物20微克/次，每隔3天免疫一次，共免疫5次；最后一次免疫2天后稱量腫瘤重量。第一組小鼠腫瘤重量為0.92g士 0. 17，第二組小鼠腫瘤重量為0. 62g士 0. 15，第三組小鼠腫瘤重量為1. 25g士0. 27，均明顯小于第四組小鼠腫瘤重量(3. 12g士0. 35)，三個(gè)疫苗處理組與第四組差異均達(dá)到極顯著水平(P < 0. 01)。注射黑色素瘤細(xì)胞B16開(kāi)始計(jì)時(shí)，45天后統(tǒng)計(jì)各組小鼠的存活率。第一組小鼠的存活率為45%，第二組小鼠的存活率為45%，第三組小鼠的存活率為45%，第四組小鼠的存活率只有15%，三個(gè)疫苗處理組與第四組比較均具有顯著差異(P < 0. 05)。說(shuō)明注射環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體或R)xP3的干擾RNA均能顯著提高gp96提取物對(duì)腫瘤抑制效果。
權(quán)利要求
1.免疫調(diào)節(jié)劑在提高gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)的免疫活性中的應(yīng)用；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的 N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。
2.如權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述含有g(shù)p96蛋白的提取物是將離體動(dòng)物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細(xì)胞的勻漿液依次進(jìn)行ConA-S^harose層析和HiTrap-Q Sepharose離子交換層析得到的；所述離體動(dòng)物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤(pán)；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞!fepG2或黑色素瘤細(xì)胞B16 ；所述ConA-S^harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為0.25ml/min ；(2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為0.5ml/min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟至終濃度為 ImM ；(3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0.25ml/min，收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7.5的PBS中力口 α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為ImM ；所述HiTrap-Q Sepharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min；(b)用5mlNaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ；(c)用IOmlNaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lml/min ；(d)用:3mlNaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min， 得到的洗脫液即為含有g(shù)p96蛋白的提取物。
3.一種疫苗佐劑，為如下(a)或(b)或(c)(a)由免疫調(diào)節(jié)劑和N355片段組成的疫苗佐劑；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25 的抗體和Γ^οχρβ的干擾RNA中的至少一種；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示； 所述N355片段序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示；(b)由免疫調(diào)節(jié)劑和gp96蛋白組成的疫苗佐劑；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25 的抗體和你即3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白如序列表的序列1所示；所述 Foxp3的干擾RNA如序列表的序列5所示；(c)由免疫調(diào)節(jié)劑和含有g(shù)p96蛋白的提取物組成的疫苗佐劑；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。
4.一種乙肝疫苗，由gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)、乙肝表面抗原、乙肝核心蛋白和免疫調(diào)節(jié)劑組成；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第 1至355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物；所述R)Xp3的干擾RNA 如序列表的序列5所示。
5.一種抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)、乙肝表面抗原、乙肝核心蛋白和免疫調(diào)節(jié)劑組成；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體和R)Xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物；所述R)xp3 的干擾RNA如序列表的序列5所示。
6.一種乙肝疫苗，由gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫調(diào)節(jié)劑組成；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗 ⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1 所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列 7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。
7.一種抑制乙肝病毒的疫苗，由gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)、乙肝表面抗原表位362-371、乙肝核心蛋白表位87-95、乙肝聚合酶表位140-148和免疫調(diào)節(jié)劑組成；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的 N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示；所述乙肝表面抗原表位362-371如序列表的序列6所示；所述乙肝核心蛋白表位87-95如序列表的序列7所示；所述乙肝聚合酶表位140-148如序列表的序列8所示。
8.—種黑色素瘤疫苗，由gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)劑組成；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗⑶25的抗體和R)xp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1所示的gp96蛋白、序列表的序列1自氨基末端第1至355位氨基酸殘基所示的 N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物；所述R)xp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。
9.如權(quán)利要求3所述的疫苗佐劑或權(quán)利要求4至8中任一所述的疫苗，其特征在于所述含有g(shù)p96蛋白的提取物是將離體動(dòng)物組織或離體腫瘤組織或離體腫瘤細(xì)胞的勻漿液依次進(jìn)行ConA-S印harose層析和HiTrap-Q Sepharose離子交換層析得到的；所述離體動(dòng)物組織為離體小鼠肝臟、離體豬肝臟或離體人胎盤(pán)；所述腫瘤組織為乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎癌、 腸癌、肝癌或胃癌；所述腫瘤細(xì)胞為人肝癌細(xì)胞H印G2或黑色素瘤細(xì)胞B16 ；所述ConA-S^harose層析包括如下步驟(1)將所述勻漿液上樣于層析柱，流速為0.25ml/min ；(2)用10倍層析柱柱體積的洗脫液甲洗滌步驟(1)的層析柱，流速為0.5ml/min ；所述洗脫液甲的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS中加苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為ImM ；(3)用3倍層析柱柱體積的洗脫液乙洗滌步驟(2)的層析柱，流速為0.25ml/min，收集洗脫液，即為洗脫液丙；所述洗脫液乙的制備方法為在NaCl濃度為200mM pH7.5的PBS中力口 α -D-吡喃葡萄糖至終濃度為10g/mL，加苯甲基磺酰氟至終濃度為ImM ；所述HiTrap-Q Sepharose離子交換層析包括如下步驟(a)將所述洗脫液丙上樣于層析柱，流速為lml/min；(b)用5mlNaCl濃度為200mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(a)的層析柱，流速為lml/min ；(c)用IOmlNaCl濃度為300mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(b)的層析柱，流速為lml/min ；(d)用:3ml NaCl濃度為600mM pH7. 5的PBS洗滌步驟(c)的層析柱，流速為lml/min， 得到的洗脫液即為含有g(shù)p96蛋白的提取物。
10.如權(quán)利要求9所述的疫苗或疫苗佐劑，其特征在于所述疫苗的各個(gè)組分均單獨(dú)包裝。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)gp96蛋白的免疫活性的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了免疫調(diào)節(jié)劑在提高gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)的免疫活性中的應(yīng)用；所述免疫調(diào)節(jié)劑為環(huán)磷酰胺、抗CD25的抗體和Foxp3的干擾RNA中的至少一種；所述gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)為序列表的序列1所示的gp96蛋白、N355片段或含有g(shù)p96蛋白的提取物；所述Foxp3的干擾RNA如序列表的序列5所示。本發(fā)明還提供了包括所述免疫調(diào)節(jié)劑和所示gp96蛋白相關(guān)物質(zhì)的各種疫苗。本發(fā)明對(duì)于各種癌癥，如乙肝、黑色素瘤等的治療具有重大價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P31/20GK102462841SQ20101053995
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者劉振, 孟頌東, 李揚(yáng), 李星輝, 王賽鋒, 胡坤, 邱立鵬, 閆曉麗, 陳立釗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所