專利名稱：具抗病毒、抗炎和/或抗菌作用的六棱菊屬提取物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及可期待具有作為治療炎癥、病菌或病毒感染引起的各種病癥藥物用途的六棱菊屬植物提取物吸其制備方法和醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
六棱菊屬(Laggera genus)是菊科中的一個屬，全球約有20種，主要分布在非洲中部及亞洲東南部?？勺鳛樗幱玫脑谖覈鴥H發(fā)現(xiàn)六棱菊(Laggera pterodonta)和四棱鋒(Laggera alata)兩種，主要分布在長江以南及西南地區(qū)。因具有顯著的抗菌消炎之功效，故云南民間把它們稱為臭靈丹，其“臭”字是因為搓揉它們的新鮮枝葉時，會散發(fā)出難聞的臭味。
六棱菊屬植物作為云南民族用藥對風(fēng)熱邪毒、癰疽、瘡癤、疥癬、血風(fēng)癬瘡等病癥有療效，《云南思茅中草藥選》記載了六棱菊具有清熱解毒、消腫拔膿的功效，對咽喉炎、口腔炎、支氣管炎、瘧疾、跌打損傷、燙燒傷、瘡癤腫毒、蛇咬傷等癥有獨特療效。近些年針對六棱菊屬植物的研究多集中于六棱菊屬植物中的低極性和中極性部位，并且得出結(jié)論認(rèn)為該屬植物富含黃酮類化合物和倍半萜類化合物(文獻(xiàn)1.李順林等。云南植物研究，1994，16(4)434-436。2.李順林等。云南植物研究，1996，18(3)349-352。3.趙昱等。(美國)天然產(chǎn)物雜志(Journal of Natural Products)，1997，60，545-549。4.趙昱等。(英國)植物化學(xué)(Phytochemistry)，1997，44，459-464。5.趙昱等。云南植物研究，1997，19(2)207-210。6.趙昱等。中國化學(xué)快報，2003，14(4)，393-396。7.趙昱等。(美國)天然產(chǎn)物雜志(Journal of Natural Products)，2003，66(8)，1078-1081。8.趙昱等。(英國)植物化學(xué)(Phytochemistry)，2003，63(7)835-839。9.趙昱等。(意大利)植物治療雜志(Fitoterapia)，2003，74(5)459-463。10.趙昱等。浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2002，31(6)406-409。)。
本發(fā)明人近幾年針對多種炎癥模型對六棱菊屬植物六棱菊和四棱鋒的提取物進(jìn)行了藥理活性研究。以陽性藥物地塞米松為對照的藥效學(xué)試驗表明，這些植物提取物的有效部位針對上呼吸道感染病癥在體內(nèi)外抗病毒、抗菌試驗和動物實驗性治療試驗中顯示出良好的活性，對二甲苯引起的小鼠耳腫脹以及角叉菜膠誘發(fā)的大鼠足趾腫脹均有明顯的抑制作用，且具有較為明顯的量效相關(guān)性；對由無菌棉球誘導(dǎo)大鼠肉芽腫有較強(qiáng)的抑制作用且有明顯的量效相關(guān)性；且動物急性毒性試驗表明毒副作用很低。本發(fā)明人出人意料地發(fā)觀六棱菊屬植物的抗炎活性成分集中在植物提取物的大極性部位，特別是富含咖啡?？崴犷惢衔锏奶崛〔课皇强寡谆钚缘挠行Р课?，有望開發(fā)成為新型的抗炎解毒的新藥，并以其無毒副作用、價格低廉等優(yōu)勢替代現(xiàn)有甾體類抗炎藥物和同類抗炎解毒中成藥，由此完成本發(fā)明。其中，咖啡酰奎尼酸類化合物是一類由奎尼酸(quinic acid)與數(shù)目不等的咖啡酸(caffeic acid)通過酯化反縮合而成的酚酸類天然成分，廣泛存在于植物界如金銀花、旋覆花、蒼耳等中藥及茶葉、山楂等果樹中。(文獻(xiàn)李祖晟、朱志安，醫(yī)學(xué)綜述，2004，10(4)，249-250)發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供了一種六棱菊屬植物中含咖啡?？崴犷惢衔锏奶崛∥?；本發(fā)明的另一目的是提供了一種制備六棱菊屬植物中含咖啡酰奎尼酸類化合物提取物的方法；本發(fā)明的另一目的是提供了將六棱菊屬植物提取物用于制備抗病毒、抗菌和/或抑制炎癥以及增強(qiáng)機(jī)機(jī)體免疫力的藥物的用途；本發(fā)明的另一目的是提供了一種含有六棱菊屬植物中的咖啡?？崴犷惢衔锾崛∥锏乃幬锝M合物。
本發(fā)明中的六棱菊屬植物中咖啡?？崴犷惢衔锾崛∥锇幢壬y定含酚性化合物含量在30％以上根據(jù)本發(fā)明人深入的研究，發(fā)現(xiàn)六棱菊屬植物的抗炎活性成分集中在植物提取物的大極性部位，通過工藝優(yōu)化，本發(fā)明人采用水或水醇溶劑提取輔以多種正、反相層析手段得到該有效部位。經(jīng)一維和二維核磁共振波譜、質(zhì)譜、紅外、紫外等光譜數(shù)據(jù)，我們得知此大極性有效部位主要有效成分為不同取代數(shù)量和不同取代位置的咖啡?；崴犷惢衔?。近代藥理學(xué)試驗研究表明此類咖啡酰基奎尼酸類化合物具有多種重要生理活性，主要是針對免疫系統(tǒng)的作用表現(xiàn)在抑制白三烯合成和釋放，抑制乙肝病毒和艾滋病毒，抑制組胺釋放，從而可用于抗炎、抗病毒和治療過敏性疾病。此外還發(fā)現(xiàn)其具有強(qiáng)效抗氧化作用、抑制脂氧酶抗動脈粥樣硬化作用、抗血小板聚集活性以及降血脂作用等活性。值得關(guān)注的是咖啡酰基奎尼酸類化合物還發(fā)現(xiàn)具有抗肝纖維化和通過對抑制豚鼠平滑肌收縮而用于急慢性支氣管炎、支氣管哮喘等癥(文獻(xiàn)李祖晟、朱志安，醫(yī)學(xué)綜述，2004，10(4)，249-250)。同時，本發(fā)明中的咖啡酰基奎尼酸類化合物在有效部位中含量較高，可以作為指標(biāo)性成分進(jìn)行六棱菊提取物藥物的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
具體而言，本發(fā)明的含有咖啡酰奎尼酸類化合物的六棱菊屬植物提取物是按照包括下列步驟的方法制備得到的a)用水或者水-強(qiáng)極性有機(jī)溶劑的混和液提取經(jīng)粉碎或切成小段的六棱菊屬植物，濃縮提取液，回收溶劑；b)將步驟a)得到的濃縮液經(jīng)柱層析，水洗，然后用丙酮、醇或者是它們與水的混合溶劑洗脫；c)將步驟b)得到的洗脫液減壓濃縮至無醇味，干燥，粉碎得產(chǎn)品。
上述制備方法進(jìn)一步包括下列步驟a)用水或者水-強(qiáng)極性有機(jī)溶劑的混和液提取經(jīng)粉碎或切成小段的六棱菊屬植物，濃縮提取液回收有機(jī)溶劑，并經(jīng)離心去除雜質(zhì)后得到澄清的濃縮液；b)將步驟a得到的濃縮液經(jīng)柱層析，先以水洗至近無色，繼以丙酮、醇或者是它們與水的混合物洗脫；c)將洗脫液減壓濃縮至無醇味，采用噴霧干燥法進(jìn)行干燥，得到粉末較細(xì)色澤均勻的有效部位，該有效部位為主要含有咖啡?？崴犷惢衔锏幕旌衔?。
在本發(fā)明的六棱菊屬植物提取物的制備方法中，步驟a)中的水-強(qiáng)極性有機(jī)溶劑的混和液優(yōu)選醇水混合溶劑，其中醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇或它們的混合物，優(yōu)選甲醇或乙醇。醇水混合溶劑可以是醇和水以任意比例混合的溶劑，優(yōu)選乙醇和水的混合溶劑，尤其優(yōu)選30-75％的乙醇水溶液。提取溶劑的用量為藥材的1-20倍量(重量倍數(shù))，優(yōu)選5-10倍量，提取時間和提取次數(shù)根據(jù)藥材和提取溶劑的種類和用量而定，一般提取時間為1-5小時，提取次數(shù)為1-5。步驟b)中柱層析所用介質(zhì)可以是硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、離子交換樹脂、氧化鋁、葡聚糖凝膠(Sephadex)類，優(yōu)選大孔樹脂和聚酰按。洗脫溶劑優(yōu)選30-95％的乙醇和水的混合溶劑洗脫，或者30-95％的乙醇和水的混合溶劑進(jìn)行梯度洗脫。步驟c)中濃縮后待噴霧干燥溶液的密度在1.0～1.4內(nèi)，優(yōu)選1.05～1.10。
在本發(fā)明的六棱菊屬植物提取物的制備方法中，六棱菊屬植物可以是六棱菊屬任一植物的任一部位，既可以是六棱菊屬(Laggera spp)任一植物的根、莖、葉、種子、皮、果實，也可以是它們的混合物，優(yōu)選全草和地上部分。更優(yōu)選六棱菊(Laggera pterodonta)和/或四棱鋒(Laggera alata)的全草或地上部分。
本發(fā)明的六棱菊屬植物提取物的進(jìn)一步優(yōu)選制備方法是，其中步驟a)中的溶劑為水，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小時；步驟b)中的柱層析所用介質(zhì)是硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、離子交換樹脂、氧化鋁或葡聚糖凝膠(Sephadex)類，優(yōu)選大孔樹脂或聚酰胺，洗脫溶劑是乙醇的水溶液，優(yōu)選50-80％的乙醇。
本發(fā)明的六棱菊屬植物提取物的另一種優(yōu)選制備方法是，其中步驟a)中的溶劑是醇水混合溶劑，其中醇是甲醇、乙醇、乙二醇或者它們的混合物，優(yōu)選30-75％的乙醇水溶液，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小時；步驟b)中的柱層析所用介質(zhì)是硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、離子交換樹脂、氧化鋁或葡聚糖凝膠(Sephadex)類，優(yōu)選大孔樹脂或聚酰胺，洗脫溶劑是乙醇的水溶液，優(yōu)選50-80％的乙醇。
本發(fā)明的六棱菊屬植物提取物中含有30％-90％的咖啡酰奎尼酸類化合物，優(yōu)選含有50％-90％的咖啡酰奎尼酸類化合物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明得到的六棱菊屬植物提取物具有抗病毒、抑制炎癥、和/或抗菌，以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功能；可以用于治療細(xì)菌或者病毒引起的炎癥及其它誘因誘發(fā)的炎癥等。所述炎癥可以包括咽喉炎癥，肺炎，腮腺炎，以及由上呼吸道感染引起的其他炎癥。病毒可以是指流感病毒或其他主要引起上呼吸道感染或者肺部感染的病毒。從而可能開發(fā)出抗病毒、抗菌、抗炎和/或增強(qiáng)人體免疫功能類藥物組合物。這種藥物組合物可以用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)制成，可以制成各種劑型，如片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、滴丸、注射劑、透皮貼劑、氣霧劑等。這些藥物組合物可以用于治療病毒或細(xì)菌感染疾病和各種炎癥，增強(qiáng)人體免疫力等用途。
下面通過實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。必須說明下述實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
具體實施例方式
實施例1六棱菊屬植物不同提取物對二甲苯致炎小鼠耳腫脹抑制試驗1.不同提取物的制備1.1.六棱菊水提物的制備 六棱菊藥材300克，加水3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得。
1.2.六棱菊醇提物的制備 六棱菊藥材300克，加50％乙醇3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得。
1.3.六棱菊揮發(fā)油的制備 六棱菊藥材450克，加水3,600毫升，接揮發(fā)油提取裝置，提取揮發(fā)油，冷卻，即得1.9917克。用前以吐溫80溶解并稀釋。
1.4.四棱鋒水提物的制備 四棱鋒藥材300克，加水3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得。
1.5.四棱鋒醇提物的制備 四棱鋒藥材300克，加50％乙醇3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小時。合并提取液，減壓濃縮至干，真空干燥，即得。
2.小鼠耳腫脹模型的篩選實驗2.1.方法與步驟2.1.1、動物分組、編號及稱重，每組10只，共5組。
2.1.2、按實驗設(shè)計濃度用滅菌生理鹽水配制各組藥物。陽性藥物用醋酸地塞米松片劑，DEX，5.0毫克/公斤；NS組滅菌生理鹽水，各試藥組的低劑量組為100毫克/公斤，中劑量組為200毫克/公斤，高劑量組為400毫克/公斤，揮發(fā)油按照其在藥材中的含量分別加入。
2.1.3、各組小鼠按相應(yīng)劑量灌胃給藥3天，1次/天，末次給藥后60分鐘，用20微升二甲苯在小鼠右耳廓復(fù)制局部炎癥，左耳做對照。致炎后60分鐘，小鼠頸椎脫臼處死，剪下左右耳廓，用直徑9毫米的打孔器沖下左右耳片，稱重。
以同一小鼠左右耳片的重量差表示“腫脹度”，統(tǒng)計比較陽性組和試藥組與生理鹽水組小鼠耳廓腫脹度的差異是否顯著。
注

2.2.結(jié)果表1-1小鼠耳腫脹試驗結(jié)果(抑制率％)

結(jié)果表明，藥材水提物和醇提物對該炎癥模型在高劑量均具有較強(qiáng)的抑制活性。揮發(fā)油基本上不具抑制活性。
實施例2六棱菊屬植物不同提取部位對二甲苯致炎小鼠耳腫脹抑制試驗1.不同提取物的制備1.1.六棱菊水提物的制備 取10公斤六棱菊藥材風(fēng)干的樣品，切成小段，以80L水提取三次，每次兩小時，合并提取液，濃縮，離心去除雜質(zhì)，濃縮液上樣于已處理好的樹脂，以水洗至色較淺，繼以70％乙醇冼脫至色淺，洗脫液減壓回收溶劑，真空干燥，即得。
1.2.六棱菊石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物的制備 取10公斤六棱菊藥材風(fēng)干的樣品，粉碎，以100L 95％乙醇熱提兩次，每次兩小時，合并提取液，用蒸餾水制成懸浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分配萃取，真空干燥，即得。
1.3.六棱菊乙醇提取物的制備 取10公斤六棱菊藥材風(fēng)干的樣品，粉碎，以50L70％乙醇提取三次，每次兩小時，合并提取液，濃縮，離心去除雜質(zhì)，濃縮液上樣于已處理好的樹脂，以水洗至色較淺，繼以50％乙醇冼脫至色淺，洗脫液減壓回收溶劑，真空干燥，即得。
1.4.四棱鋒石油醚及乙酸乙酯部位提取物的制備 取10公斤四棱鋒藥材風(fēng)干的樣品，粉碎，以80L 95％乙醇熱提兩次，每次兩小時，合并提取液，用蒸餾水制成懸浮液后依次用石油醚和乙酸乙酯分配萃取，真空干燥，即得。
1.5.四棱鋒乙醇提取物的制備 取10公斤四棱鋒藥材風(fēng)干的樣品，粉碎，以100L70％乙醇提取三次，每次兩小時，合并提取液，濃縮，離心去除雜質(zhì)，濃縮液上樣于已處理好的樹脂，以水洗至色較淺，繼以50％乙醇洗脫至色淺，洗脫液減壓回收溶劑，真空干燥，即得。
2.小鼠耳腫脹模型的篩選實驗2.1.方法與步驟2.1.1、動物分組、編號及稱重，每組10只，共5組。
2.1.2、按實驗設(shè)計濃度用滅菌生理鹽水配制各組藥物。陽性藥物用醋酸地塞米松片劑，DEX，5.0毫克/公斤；NS組滅菌生理鹽水，各試藥組的低劑量組為100毫克/公斤，中劑量組為200毫克/公斤，高劑量組為400毫克/公斤，揮發(fā)油按照其在藥材中的含量分別加入。
2.1.3、各組小鼠按相應(yīng)劑量灌胃給藥3天，1次/天，末次給藥后60分鐘，用20微升二甲苯在小鼠右耳廓復(fù)制局部炎癥，左耳做對照。
致炎后60分鐘，小鼠頸椎脫臼處死，剪下左右耳廓，用直徑9毫米的打孔器沖下左右耳片，稱重。
以同一小鼠左右耳片的重量差表示“腫脹度”，統(tǒng)計比較陽性組和試藥組與生理鹽水組小鼠耳廓腫脹度的差異是否顯著。
注 2.2.結(jié)果
表2-1小鼠耳腫脹試驗結(jié)果(抑制率％)

結(jié)果表明，六棱菊水提部位、六棱菊醇提部位、四棱鋒醇提部位，以及它們的組合物對該炎癥模型在高劑量均具有較強(qiáng)的抑制活性。
實施例3六棱菊植物中酚酸類化合物及藥物組合物的制備取10公斤六棱菊藥材風(fēng)干的樣品，切成小段，以水提取三次，第一次用8倍量，第二次用6倍量，第三次用6倍量。加水第1次提取1.5小時，第2、3次提取1小時，濃縮，離心去除雜質(zhì)，濃縮液上樣于已處理好的樹脂，以水洗至色較淺，繼以70％乙醇冼脫至色淺，洗脫液減壓回收溶劑，噴霧干燥得原料細(xì)粉，批號為031225。此即為本發(fā)明中六棱菊植物提取物的有效部位，以下簡稱為AIII5。以原料(淀粉+微晶纖維素)按一定比例(1∶0.5～1∶3，其中淀粉微晶纖維素的范圍為1∶0～0∶1)制粒后套入膠囊中(根據(jù)需要可以是0～4號膠囊)，即得。
按比色法測定AIII5中含酚性化合物含量在30％以上，具體方法為1.儀器與試藥紫外可見分光光度儀；十萬分之一天平；甲醇，鐵氰化鉀，三氯化鐵，鹽酸為分析純；十二烷基磺酸鈉為化學(xué)純。化合物1對照品由浙江大學(xué)藥學(xué)院中藥與天然藥物研究室提供，六棱菊屬植物的提取物AIII5為噴干粉末。
2.方法與結(jié)果
2.1顯色反應(yīng)試劑的制備 精密稱取十二烷基磺酸鈉3.0克，加水1000毫升使溶解，得十二烷基磺酸鈉試液；取鐵氰化鉀0.6克，加水溶解成100毫升，得鐵氰化鉀試劑；取三氯化鐵六水合物0.9克，加水溶解成100毫升，得三氯化鐵試液。
2.2對照品溶液的制備 精密稱取化合物1對照品2.73毫克，以甲醇溶解并定容至25毫升。
2.3供試品溶液的制備 取六棱菊屬植物的提取物AIII5(批號為031225)25毫克，以50％甲醇溶解并定容至25毫升。
2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液1毫升，2毫升，3毫升，4毫升，5毫升，6毫升于25毫升量瓶中，加甲醇至6毫升，再分別精密加入0.3％十二烷基磺酸鈉2.0毫升，0.6％鐵氰化鉀-0.9％三氯化鐵(1∶1)2.0毫升，搖勻，暗處放置5分鐘，加0.1莫爾/升鹽酸溶液至25毫升，搖勻，暗處放置20分鐘，以甲醇為空白，在700納米處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表3-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝3.7964x+0.0847，相關(guān)系數(shù)r＝0.9983，線性范圍為0.1092毫克～0.6552毫克。
表3-1不同質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品吸光度結(jié)果

2.5樣品含量測定 精密吸取供試品溶液1毫升于25毫升量瓶中，加甲醇至6毫升，余同1.24項下，以甲醇為空白，在700納米處測定吸光度。并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品總酚含量。結(jié)果提取物總酚含量為54.4％。
實施例4.由實施例3制備得到的原料AIII5對角叉菜膠導(dǎo)致的大鼠足趾腫脹抑制試驗1.材料和方法
1.1動物SD大鼠150+20g，由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號，皖實動準(zhǔn)字01號。
1.2試驗藥AIII5批號20031015；陽性對照藥雷公藤多苷(TWM)批號030402，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
1.3主要儀器MK-500型足爪容積測定儀日本Mukomachi Kiai CD公司產(chǎn)品。
1.4方法SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即模型對照組、AIII5(35，70，140毫克/公斤)三個劑量組和陽性對照藥雷公藤多苷(40毫克/公斤)組。灌胃給藥5天，第5天給藥1小時后于每個鼠右后足跖腱膜下注射10克·L-1角叉菜膠(用生理鹽水配制)0.1毫升致炎，用足爪容積測量儀分別測定右后足爪致炎前與致炎后1、3、5、7小時致炎側(cè)足容積。
采用SPSS統(tǒng)計軟件分析給藥組和對照組足爪腫脹度的差異。
2結(jié)果SD大鼠在致炎后1小時，足爪開始腫脹，3小時后腫脹明顯，5～7小時到峰值。AIII5(35，70，140毫克/公斤)和陽性對照藥雷公藤多苷(40毫克/公斤)能明顯抑制足爪腫脹。各藥組的足爪腫脹也在5～7小時達(dá)峰值，但峰值比模型組明顯低。說明AIII5具有顯著的消腫作用。見表4-1。
表4-1 AIII5對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足爪腫脹度的影響(x±s，n＝10)

*P＜0.05，**P＜0.01皆與模型組比較實施例5由實施例3制備得到的原料AIII5對無菌棉球誘導(dǎo)大鼠肉芽腫炎癥模型的影響1.原理由于植入大鼠皮下棉球的刺激作用，引起結(jié)締組織增生，產(chǎn)生異體肉芽腫，這種肉芽增生與某些炎癥的后期病理改變相似。故可通過定量分析試驗藥物對肉芽增生的抑制程度來恒量該藥物的抗炎活性強(qiáng)弱。
2.試驗藥物試驗藥物AIII5用DMSO分別配制成濃度為20毫克/毫升、10毫克/毫升、5毫克/毫升。
陽性藥物吲哚美辛(Indolmethacin)用NS配制成1毫克/毫升。
3.分組NS組；DMSO組；Indolmethacin組10毫克/公斤；AIII5(H)組200毫克/公斤；AIII5(M)組100毫克/公斤；AIII5(L)組50毫克/公斤。(注分為6組，每組8只大鼠，均為ig給藥，0.1毫升/10g體重。)4.方法與步驟各組動物按相應(yīng)劑量灌胃給藥。給藥后1小時用乙醚麻醉。先用固定板固定大鼠，再用滅菌NS濕潤大鼠左右腋窩下皮膚，并剪去相應(yīng)被毛。碘酊、酒精棉球消毒術(shù)部，用手術(shù)刀作一長約8～10mm的橫切口，再用止血鉗在腋窩下皮下靠近背部擴(kuò)充皮下組織。在每側(cè)腋窩皮下相同部位各埋入一個滅菌棉球，結(jié)節(jié)縫合2～3針。傷口處撒上一定的青、鏈霉素抗感染，每天1次，連續(xù)4次。每天給藥1次，連續(xù)7天，第8天處死，手術(shù)取出棉球，稱濕重。60℃烘干棉球至恒重，減去棉球原重，即為肉芽組織重量。統(tǒng)計分析藥物組與模型組肉芽腫重量差異是否顯著，并計算其抑制率。
5結(jié)論通過采用“無菌棉球誘導(dǎo)大鼠肉芽腫炎癥模型”檢測AIII5三個劑量(200毫克/公斤、100毫克/公斤、50毫克/公斤)的抗炎活性，結(jié)果表明(1)若采用肉芽腫重量(毫克)統(tǒng)計AIII5(M)組與DMSO組比較差異非常顯著(P＜0.01)；AIII5(H)、AIII5(M)和AIII5(L)組的抑制率分別為17.38％、42.5％和24.68％。
(2)若采用肉芽腫重量(毫克/100g體重)統(tǒng)計AIII5(M)組與DMSO組比較差異非常顯著(P＜0.01)；而AIII5(L)組與DMSO組比較差異顯著(P＜0.05)。AIII5(H)、AIII5(M)和AIII5(L)組的抑制率分別為23.07％、43.47％、28.93％。
(3)NS和DMSO組肉芽腫重量(毫克)分別為25.84±8.23；24.34±10.58。而NS和DMSO組肉芽腫重量(毫克/100克體重)分別為7.10±2.33；7.01±3.12。顯然二者差異很小，說明DMSO作溶劑沒有大的干擾。
上述結(jié)果表明，AIII5(M)組即100毫克/公斤劑量(相當(dāng)于人用劑量17.64毫克/公斤)對“無菌棉球誘導(dǎo)大鼠肉芽腫炎癥模型”具有顯著的抗炎活性。
實施例6由實施例3制備得到的原料AIII5對醋酸致小鼠毛細(xì)血管通透性增高模型(腹膜炎)的影響1材料與方法1.1動物昆明種小鼠，雄性，體重18～20克，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號，皖實動準(zhǔn)字01號。
1.2試驗藥AIII5批號20031015；雷公藤多苷(TWM)，批號030402，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
1.3主要儀器7530可見紫外分光光度計(上海分析儀器廠產(chǎn)品)。
1.4方法小鼠隨機(jī)分為為5組，每組10只，即溶媒組(0.5％羧甲基纖維素鈉)、AIII5(50，100，200毫克/公斤)和陽性對照(TWM，40毫克/公斤)組。灌胃給藥5天，最后一次給藥1h后，尾靜脈注射伊文思藍(lán)生理鹽水溶液0.1毫升/10克，立即腹腔注射0.6％醋酸0.2毫升/只，20分鐘后斷頭放血處死小鼠，剪開腹腔，用5毫升生理鹽水沖洗腹腔數(shù)次，收集洗滌液，離心1000轉(zhuǎn)5分鐘，在590納米處測定吸光度(absorbent，A)值。SPSS統(tǒng)計分析給藥組和對照組A值的差異。
2結(jié)果AIII5各劑量組腹腔洗液A值明顯低于溶媒組，表明其對醋酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加有顯著的抑制作用，且AIII5高劑量(200毫克/公斤)抑制作用明顯強(qiáng)于低劑量(50毫克/公斤)，具有一定的量效關(guān)系，見表6-1。
表6-1.AIII5對醋酸酸所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的抑制作用


**p＜0.001，與溶媒組比較；#p＜0.05與AIII5(50毫克/公斤)組比較實施例7由實施例3制備得到的原料AIII5對小白鼠碳粒廓清功能的影響1.材料與方法1.1實驗動物 昆明種小鼠，18～22克，雄性。購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號皖實動準(zhǔn)01號。
1.2.藥物與試劑AIII5，批號20031015；雷公藤多苷，批號030402，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。
印度墨汁上海長江日用粘合材料廠，批號881120，以生理鹽水按1∶6的倍數(shù)進(jìn)行稀釋。
0.1％Na2CO3溶液0.1克的Na2CO3加雙蒸水至100毫升。
1.3.主要儀器7530可見紫外分光光度計(上海分析儀器廠產(chǎn)品)。
1.4實驗方法1)小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即陰性對照組、AIII5(50，100，200毫克/公斤)和陽性對照組雷公藤多苷(TWM)80毫克/公斤。
2)灌胃給藥7天，于末次給藥30min后，尾靜脈注射印度墨汁0.05～0.1毫升/10克，于注射后2分鐘和12分鐘分別用吸管(預(yù)先用肝素溶液濕潤)分別從眶后靜脈叢取血20微升，溶于2毫升0.1％Na2CO3溶液中搖勻，在640納米波長下測A值。
3)計算廓清指數(shù)KK=logOD1-logOD2t1-t2]]>OD1、OD2為不同時間所取血樣的A值；t1-t2為取兩血樣的時間差。一般以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示各組K值，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗。
K值增加，說明試藥有免疫增強(qiáng)作用；K值降低，說明試藥有免疫抑制作用。
2.實驗結(jié)果與正常組比較，AIII5(100，200毫克/公斤)劑量組的廓清指數(shù)K明顯增加，而TWM組廓清指數(shù)K明顯降低，說明AIII5有免疫增強(qiáng)作用，而TWM有免疫抑制作用。見表7-1。
表7-1 AIII5對小鼠吞噬功能的影響(n＝10，x±s)

*p＜0.05，**p＜0.01，皆與正常組比較實施例8由實施例3制備得到的原料AIII5的體外抗病毒作用研究1.材料與方法1.1藥物與試劑實驗藥物AIII5，批號20031015，用前以生理鹽水溶解，使其終濃度為100毫克/毫升，過濾除菌分裝，置4℃冰箱內(nèi)放置備用；注射用雙黃連，哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn)，批號0504003；清開靈注射液，廣州明興制藥有限公司，批號050421；板蘭根顆粒，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號050201，以生理鹽水按1∶6的倍數(shù)進(jìn)行稀釋。
病毒株流感病毒FM-1鼠肺適應(yīng)株，由南京醫(yī)科大學(xué)引進(jìn)。-84℃低溫保存，復(fù)蘇后SPF雞胚傳代兩次，血凝效價為1∶1280。
細(xì)胞株狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫，常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10％FCS的RPMI 1640，維持液為含2％FCS的RPMI1640，均加入1％青霉素和鏈霉素。
SPF雞胚購自浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。
0.5％雞紅細(xì)胞懸液心臟采集健康SPF公雞雞血，抗凝去纖維，Alsever氏液中4℃保存(不超過10天)，臨用前以0.85％滅菌生理鹽水洗滌3次，制成0.5％雞紅細(xì)胞懸液。
試劑小牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司，批號041117；RPMI 1640培養(yǎng)液，Gibco公司出品，批號2535081；Hanks液，取預(yù)先配制好的A、B母液(20倍濃縮)，1∶1混勻后稀釋20倍作為使用液，過濾，分裝，4℃保存；PBS，稱取NaCl 8.0克、KCl 0.2克、NaHPO4·12H2O2.9克、KH2PO40.2克，加雙蒸水至1000毫升，充分溶解后，分裝、高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?；?xì)胞消化液(VTP)，稱取2.5克胰酶和0.2克EDTA，加入1000毫升PBS，再加入配好的雙抗10毫升，混勻后過濾，分裝為4毫升/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆?；雙抗，青霉素2瓶×80萬單位，鏈霉素100萬單位，加入100毫升Hanks液中，過濾，分裝為5毫升/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 1.3.主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱美國Shellab公司產(chǎn)品；生物安全柜美國Labcanco產(chǎn)品；倒置顯微鏡重慶光電儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫箱上海森信實驗儀器有限公司；Synergy-HT酶標(biāo)儀美國Bio-Tek公司產(chǎn)品。立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。
1.4.實驗方法采用微量細(xì)胞病變抑制法，以利巴韋林(病毒唑)，清開靈，雙黃連，板蘭根為陽性對照藥，從AIII5的最大無毒濃度開始，測定AIII5抗流感病毒FM-1株的半數(shù)有效濃度(EC50)，治療指數(shù)。
1.4.1.病毒毒力測定將病毒按常規(guī)接種于9-11日齡的雞胚尿囊腔中，35℃培育72小時，4℃冰箱過夜，收集尿囊液，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集實驗，測得病毒效價為1∶1280。觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，結(jié)果記錄為“++++”為100％病變；“+++”為75％病變；“++”為50％病變；“+”為25％病變“-”為陰性結(jié)果。觀察結(jié)束后將96孔板結(jié)晶紫染色后保存。
1.4.2.試驗藥細(xì)胞毒性測定將配好的試驗藥品原液，分別用無血清1640液作連續(xù)10倍的系列稀釋，稀釋6個濃度，并標(biāo)記為原液(100毫克/毫升)，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-67個濃度。然后將原液和6個濃度藥液分別加入已長成單層的MDCK細(xì)胞板中，每孔100微升，每個濃度重復(fù)4個孔，并設(shè)正常細(xì)胞對照。整個實驗重復(fù)3次。細(xì)胞在37℃，5％二氧化碳，100％相對濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72小時，然后每孔加入10微升5毫克/毫升的MTT溶液(用生理鹽水配制)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時。吸去上清，每孔加入150微升DMSO，振蕩使甲臢溶解，在570納米波長下測定OD值。計算抑制率和IC50抑制率＝(OD對照-OD樣品)/OD對照×100％；通過回歸計算出藥品對MDCK細(xì)胞的IC50。
1.4.3.藥物對流感病毒的抑制作用選用健康、新鮮受精SPF雞胚，消毒備用。雞胚隨機(jī)分為14組，每組5胚，即AIII5六個劑量組(最大無毒濃度用生理鹽水連續(xù)做10倍稀釋)、陽性對照藥六個劑量組(最大無毒濃度用生理鹽水連續(xù)做10倍稀釋)、生理鹽水對照組和病毒對照組。將不同稀釋度的藥液注入雞胚中，0.25毫升/每胚，30分鐘后經(jīng)相同途徑注入100 EID50的病毒0.1毫升，對照組以生理鹽水代替。35℃溫箱孵育5天。收獲尿囊液，測其血凝效價。能抑制其血凝效價32倍以上所注射的最小藥量，即為其抑制效價(MIC)。
2.結(jié)果2.1.微量細(xì)胞病變抑制法測定AIII5體外對FM-1的抑制作用，結(jié)果見表8-1表8-1.AIII5體外對FM-1病毒的抑制作用

2.1.按Reed-Muench分別計算AIII5和陽性藥物的抗流感病毒效果，結(jié)果見表8-2。
表8-2.AIII5及陽性藥物對流感病毒的抑制作用比較(微克/毫升)

3.結(jié)論AIII5在體外具有強(qiáng)效抑制流感病毒FM-1的作用，其抑制作用與利巴韋林(病毒唑)相似；對FM-1的抑制作用均強(qiáng)于清開靈，雙黃連和板蘭根。
實施例9由實施例3制備得到的原料AIII5的體內(nèi)抗病毒作用研究1.材料與方法1.1藥物與試劑實驗藥物AIII5，批號20031015，用前以生理鹽水溶解，使其終濃度為100毫克/毫升，過濾除菌分裝置4℃冰箱內(nèi)放置備用；注射用雙黃連，哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn)，批號0504003；清開靈注射液，廣州明興制藥有限公司，批號050421；板蘭根顆粒，杭州胡慶余堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號050201，以生理鹽水按1∶6的倍數(shù)進(jìn)行稀釋。
病毒株流感病毒FM-1鼠肺適應(yīng)株，由南京醫(yī)科大學(xué)引進(jìn)。-84℃低溫保存，復(fù)蘇后SPF雞胚傳代兩次，血凝效價為1∶1280。
試劑小牛血清，購自杭州四季青生物工程材料有限公司，批號041117。融化后56℃滅活30分鐘，置4℃保存?zhèn)溆?；RPMI 1640培養(yǎng)液，Gibco公司出品，批號2535081，1000毫升RPMI 1640培養(yǎng)液含2克NaHCO3、0.11g丙酮酸鈉及1％青霉素和鏈霉素，置4℃保存?zhèn)溆茫籋anks液，取預(yù)先配制好的A、B母液(20倍濃縮)，1∶1混勻后稀釋20倍作為使用液，過濾，分裝，4℃保存；PBS，稱取NaCl8.0克、KCl 0.2克、NaHPO4·12H2O 2.9克、KH2PO4 0.2克，加雙蒸水至1000毫升，充分溶解后，分裝、高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?；?xì)胞消化液(VTP)，稱取2.5克胰酶和0.2克EDTA，加入1000毫升PBS，再加入配好的雙抗10毫升，混勻后過濾，分裝為4毫升/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆茫浑p抗，青霉素2瓶×80萬單位，鏈霉素100萬單位，加入100毫升Hanks液中，過濾，分裝為5毫升/瓶，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 1.3.主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱美國Shellab公司產(chǎn)品；生物安全柜美國Labcanco產(chǎn)品；倒置顯微鏡重慶光電義器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫箱上海森信實驗儀器有限公司；Synergy-HT酶標(biāo)儀美國Bio-Tek公司產(chǎn)品。立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。
1.4.實驗方法1.4.1.病毒對小鼠感染毒力測定昆明種小鼠共60只，體重20±2克，乙醚淺麻醉，以5個10倍稀釋度病毒液滴鼻感染，每組10只，同時設(shè)1組作正常動物對照，每鼻孔0.03毫升。觀察2周，記錄發(fā)病死亡數(shù)，計算半數(shù)死亡量(LD50)。如不發(fā)病或發(fā)病不死亡，取標(biāo)本檢測病毒，計算半數(shù)感染量(ID50)。
1.4.2.試驗藥品對流感病毒致小鼠出血性肺炎的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率的測定將小鼠隨機(jī)分為9組，每組20只，即正常對照組；病毒對照組；；AIII5(大、中、小劑量)三個劑量組，利巴韋林組，清開靈組，雙黃連組和板蘭根組。用AIII5對小鼠的最大耐受劑量(LD0＝3克/公斤)的1/2、1/4、1/8三個劑量，按體重灌胃給藥，每只鼠＜0.5ml，分別用TCM06的三個濃度，即100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml劑量給藥，2次/日，預(yù)防性給藥3天后，用15倍LD50病毒量滴鼻感染小鼠，每鼻孔0.03毫升。感染后連續(xù)給藥4天，第4天將每組動物的第1小組稱取體重并放血殺死。解剖小鼠，取出全肺，放入盛有蒸餾水平皿中洗滌兩次，摘除氣管、肺門淋巴結(jié)等組織，吸水紙吸干后稱重，計算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。肺指數(shù)＝小鼠肺重/小鼠體重×100％；肺指數(shù)抑制率＝(病毒對照組平均肺指數(shù)-實驗組平均肺指數(shù))/病毒對照組平均肺指數(shù)×100％。每組剩下的第2小組動物繼續(xù)給藥2天(共6天)，觀察2周，逐日記錄死亡數(shù)。
計算死亡保護(hù)率(％)＝(病毒對照組死亡率-實驗組死亡率)×100％；各組平均死亡日＝14-平均存活日。各組平均存活日采用COX生存分析，平均存活日組間比較采用LogRank檢驗。
2.結(jié)果2.1.流感病毒對小鼠毒力測定采用Reed-Muench法計算，流感病毒FM-1在小鼠體內(nèi)的LD50為10-3.82，查反對數(shù)得，LD50為原液6607倍稀釋，藥效學(xué)試驗中，采用15倍LD50病毒濃度，即病毒原液作440倍稀釋。見表9-1。
表9-1.流感病毒在小鼠體內(nèi)的LD50計算

2.2.AIII5對流感病毒致小鼠出血性肺炎的肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率的影響分別計算各組小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率。從表9-2可以看出，感染模型組體重下降明顯低于正常對照組，AIII5各劑量組和陽性藥物組均能逆轉(zhuǎn)小鼠的體重下降；感染模型組肺指數(shù)顯著低于正常對照組，AIII5各劑量組與陽性藥物組的肺指數(shù)與正常對照組無顯著改變，而明顯高于感染模型組。
表9-2.滴鼻感染后小鼠的各項指標(biāo)


##P＜0.01，與正常組比較；*P＜0.05，**P＜0.01，與病毒對照組比較。
2.3.連續(xù)觀察2周AIII5對小鼠死亡數(shù)和各項指標(biāo)的影響2.3.1小鼠每天的死亡數(shù)見表9-3表9-3.觀察2周小鼠每天的死亡數(shù)

注組別(1)為正常對照組，(2)為病毒對照組，(3)為AIII5大劑量實驗組，(4)為AIII5中劑量實驗組，(5)為AIII5小劑量實驗組，(6)為利巴韋林組，(7)為清開靈組，(8)為雙黃連組，(9)為板蘭根組。
2.3.2連續(xù)觀察2周小鼠的各項指標(biāo)見表9-4表9-4.連續(xù)觀察2周小鼠的各項指標(biāo)


注*P＜0.05，**P＜0.01，與病毒對照組比較。組別(1)為正常對照組，(2)為病毒對照組，(3)為AIII5大劑量實驗組，(4)為AIII5中劑量實驗組，(5)為AIII5小劑量實驗組，(6)為利巴韋林組，(7)為清開靈組，(8)為雙黃連組，(9)為板蘭根組。
3.結(jié)論體內(nèi)抗FM-1實驗等結(jié)果表明，AIII5對流感病毒感染小鼠有一定的保護(hù)作用。AIII5FM-1的抑制作用與利巴韋林相似；其抑制作用均強(qiáng)于清開靈，雙黃連和板蘭根。
實施例10由實施例3制備得到的原料AIII5的體外抗菌作用1.方法用液體培養(yǎng)基牛肉湯作AIII5的連續(xù)10倍稀釋(牛肉湯AIII5＝0.9毫升0.1毫升)，AIII5濃度為100毫克/毫升、10毫克/毫升、1毫克/毫升、100μg/毫升、100μg/毫升、1μg/毫升、0.1μg/毫升、0.01μg/毫升，共8個濃度，每個濃度做兩個復(fù)管，每試管加濃度為5×105個/毫升的細(xì)菌懸液0.1毫升，并設(shè)立對照。搖勻，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察每組的肉湯透明狀況。“-”為渾濁，無抑菌效果。見表6。
2.結(jié)果從表6可以看出肉湯培養(yǎng)中，濃度為100毫克/毫升、10毫克/毫升的AIII5對金黃色葡萄球菌(G+)有抑菌作用。AIII5對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)均為10毫克/毫升。
表10-1 AIII5體外抗菌實驗(試管法)


注“-”表示為渾濁實施例11由實施例3制備得到的原料AIII5對綿羊紅細(xì)胞所致小鼠溶血素抗體生成的影響1.材料與方法1.1實驗動物昆明種小鼠，18～22g，雄性。購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號皖實動準(zhǔn)01號。
1.2藥物與試劑AIII5，批號20031015；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，上海華聯(lián)制藥有限公司，批號030506；Alsever溶液(葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.80g，氯化鈉0.42g，雙蒸水100毫升，無菌過濾)；都氏試劑(碳酸氫鈉1.0g，氰化鉀0.05g，高鐵氰化鉀0.2g，雙蒸水1000毫升)；豚鼠血清(補體)的制備豚鼠心臟取血，分離血清并稀釋，血清∶SRBC＝1∶0.2(V/V)，于4℃冰箱放置30min，2000rpm離心10min，吸取上清液，用生理鹽水稀釋成1∶10血清備用。
1.3主要儀器7530可見紫外分光光度計(上海分析儀器廠產(chǎn)品)；TDL-16c臺式高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。
1.4實驗方法1)小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即正常對照組、AIII5(50，100，200毫克/公斤)和環(huán)磷酰胺陽性對照組。AIII5用藥組連續(xù)灌胃8天，環(huán)磷酰胺組皮下注射環(huán)磷酰胺40毫克/公斤/日，連續(xù)用藥3天。
2)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)懸液制備 無菌條件下，從綿羊外頸靜脈取血，置于盛有玻璃珠的滅菌錐型瓶中，搖動10min除去纖維蛋白，加入相當(dāng)于羊血體積2倍的Alsever溶液搖勻，置于4℃冰箱中備用。臨用時取上述保存的羊紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，每次1000～2000rpm離心5min，棄去上清液，再用生理鹽水以3∶5(v/v)稀釋，濃度為2×1010個/毫升。
3)免疫及給藥 小鼠于第2次用藥后腹腔注射SRBC懸液0.2毫升/只，對照組以同樣方法免疫，于免疫后7天，眼眶取血進(jìn)行溶血素測定。
4)溶血素測定 取血1毫升于離心管中放置1h后，用長針將凝固血與管壁剝離，使血清充分滲出，離心取血清，用生理鹽水稀釋500倍，再取1毫升加入反應(yīng)管中，再加入10％0.5毫升SRBC，并于每管中加入1毫升以生理鹽水1∶10稀釋的豚鼠血清，立即置入37℃恒溫水浴中，保溫10min，即放入冰浴以終止反應(yīng)，離心取上清1毫升，加3毫升都氏試劑，混勻放置10min后，在540nm下測吸光度A值。
5)羊紅細(xì)胞半數(shù)溶血時A值的測定 取0.25毫升SRBC用都氏液稀釋至4毫升，搖勻，放置10min，離心取上清液，于540nm測吸光度A值。
6)半數(shù)溶血值HC50的計算

將給藥組的平均HC50值與對照組平均HC50進(jìn)行t檢驗來判斷其差異顯著性。給藥后溶血素增多，A值高或HC50增高，則說明藥物可增強(qiáng)體液免疫。
2.結(jié)果實驗結(jié)果表明AIII5(100，200毫克/公斤)劑量組能明顯提高小鼠產(chǎn)生溶血素水平，說明AIII5可增強(qiáng)體液免疫。而環(huán)磷酰胺組能降低小鼠產(chǎn)生溶血素水平。
表11-1 AIII5對綿羊紅細(xì)胞所致小鼠溶血素抗體生成的影響(n＝10，x±s)

*p＜0.05，**p＜0.01vs normal
實施例12由實施例3制備得到的原料AIII5組合物片劑的制備方法用原料AIII52,000毫克，按照藥劑學(xué)一般壓片法混勻后加輔料8,000毫克，壓制成100片。每片重100毫克。
實施例13由實施例3制備得到的原料AIII5組合物膠囊劑的制備方法用原料AIII55,000毫克，以原料∶(淀粉+微晶纖維素)按比例(1∶1)，其中淀粉∶微晶纖維素1∶1制粒后套入0號空心膠囊中。共裝100粒，每個膠囊重100毫克。
權(quán)利要求
1.一種具有抗病毒、抗炎、和/或抗菌功能的六棱菊屬植物提取物，其由包含下列步驟的方法制備得到a)用水或水-強(qiáng)極性有機(jī)溶劑的混和液提取經(jīng)粉碎或切成小段的六棱菊屬植物，濃縮提取液，回收溶劑；b)將步驟a)得到的濃縮液經(jīng)柱層析，水洗，然后用用丙酮、醇或者是它們與水的混合溶劑洗脫；c)將步驟b)得到的洗脫液減壓濃縮至無醇味，干燥，粉碎得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的六棱菊屬植物提取物，其制備方法的步驟a)中的水-強(qiáng)極性有機(jī)溶劑的混和液是醇水混合溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的六棱菊屬植物提取物，其制備方法的步驟a)中的提取溶劑的重量為藥材重量的1-20倍，提取時間為1-5小時，提取次數(shù)為1-5次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的六棱菊屬植物提取物，其制備方法的步驟b)中的柱層析所用介質(zhì)是硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、離子交換樹脂、氧化鋁或葡聚糖凝膠(Sephadex)類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的六棱菊屬植物提取物，其中的六棱菊屬植物是六棱菊和/或四棱鋒，提取部位是根、莖、葉、種子、皮、果實，或它們的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的六棱菊屬植物提取物，其中的提取部位是全草或地上部分。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的六棱菊屬植物提取物，其制備方法的步驟a)中的提取溶劑為水，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小時；步驟b)中的柱層析所用介質(zhì)是硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、離子交換樹脂、氧化鋁或葡聚糖凝膠(Sephadex)類，洗脫溶劑是乙醇的水溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的六棱菊屬植物提取物，其中步驟b)中的柱層析所用介質(zhì)是大孔樹脂或聚酰胺，洗脫溶劑是50-80％的乙醇。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的六棱菊屬植物提取物，其中步驟a)中的提取溶劑是醇水混合溶劑，其中醇是甲醇、乙醇、乙二醇或者它們的混合物；步驟b)中的柱層析所用介質(zhì)是硅膠、反相硅膠、大孔樹脂、聚酰胺、離子交換樹脂、氧化鋁或葡聚煻凝膠(Sephadex)類，洗脫溶劑是乙醇的水溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的六棱菊屬植物提取物，其中步驟a)中的提取溶劑是30-75％的乙醇水溶液，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小時；步驟b)中的柱層析所用介質(zhì)是大孔樹脂或聚酰胺，洗脫溶劑是50-80％的乙醇。
11.權(quán)利要求1-10之一的六棱菊屬植物提取物，其含有30％-90％的咖啡酰奎尼酸類化合物。
12.權(quán)利要求1-10之一的六棱菊屬植物提取物，其含有50％-90％的咖啡?？崴犷惢衔?。
13.權(quán)利要求1-12之一的六棱菊屬植物提取物用于制備治療炎癥、病菌或病毒感染引起的各種病癥的藥物的用途，其中炎癥包括咽喉炎癥，肺炎，腮腺炎，以及由上呼吸道感染引起的其他炎癥，病毒是流感病毒或其他主要引起上呼吸道感染或者肺部感染的病毒。
14.一種具有抗病毒、抗炎和/或抗菌功能的藥物組合物，其含有治療有效量的權(quán)利要求1-12之一的提取物和可藥用載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其可以是片劑、顆粒劑、膠囊、口服液、注射劑、滴丸、透皮貼劑、外用搽劑或氣霧劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可期待具有作為治療炎癥、病菌或病毒感染引起的各種病癥藥物用途的六棱菊屬植物提取物及其制備方法和醫(yī)藥用途。本發(fā)明的六棱菊屬植物提取物由六棱菊屬植物鮮品或干品經(jīng)醇水提取、柱層析、醇溶劑洗脫精制而成，提取物中咖啡?？崴犷惢衔锖吭?0％以上。本發(fā)明得到的六棱菊屬植物提取物具有明顯地抗病毒、提高免疫力、抗炎、和/或抗菌功效，可以用于治療各種急慢性炎癥、病毒或病菌感染引起的各種病癥。
文檔編號A61K9/08GK1883530SQ20051007745
公開日2006年12月27日 申請日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者趙昱, 周長新, 于榮敏, 伍義行, 孫先鳳, 趙軍, 李海波, 白驊 申請人:趙昱, 于榮敏, 周長新