專利名稱：含有羥肟酸衍生物的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及適用于保護(hù)線粒體基因組和/或線粒體免受損傷或治療與這種損傷相關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物，所說(shuō)的組合物含有作為活性成分的下列式(I)的羥肟酸衍生物，或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽
其中R1代表氫或C1-5烷基，R2代表氫、C1-5烷基、C3-8環(huán)烷基或可被羥基或苯基取代的苯基；或者R1和R2與它們所連接的氮原子一起形成5至8元環(huán)，該環(huán)還可另外含一個(gè)或多個(gè)氮、氧或硫原子，并且所說(shuō)的環(huán)可與另一個(gè)脂環(huán)或雜環(huán)縮合，優(yōu)選與苯、萘、喹啉、異喹啉、吡啶或吡唑啉環(huán)，如果需要且化學(xué)上可能時(shí)，氮和/或硫雜原子以氧化物或二氧化物的形式存在，R3代表氫、苯基、萘基或吡啶基，其中所說(shuō)的基團(tuán)可以被一個(gè)或多個(gè)鹵原子或C1-4烷氧基取代，Y是氫、羥基、可被氨基取代的C1-24烷氧基、含有1至6個(gè)雙鍵的C2-24多烯氧基、C1-25烷?；?、C3-9烯?；蚴絉7-COO-的基團(tuán)，其中R7代表含有1至6個(gè)雙鍵的C2-30多烯基，X代表鹵素、氨基、C1-4烷氧基，或者X與B形成氧原子，或者X和Y與它們所連接的碳原子以及所說(shuō)碳原子之間的-NR-O-CH2基團(tuán)一起形成有下列結(jié)構(gòu)式的環(huán)
其中Z代表氧或氮，R代表氫或R與B形成化學(xué)鍵，A是C1-4亞烷基或化學(xué)鍵或有下列結(jié)構(gòu)式的基團(tuán)
其中R4代表氫、C1-5烷基、C3-8環(huán)烷基或可被鹵素、C1-4烷氧基或C1-5烷基取代的苯基，R5代表氫、C1-4烷基或苯基，m為0、1或2，n為0、1或2。
匈牙利專利HU-P No.177578和其等同的美國(guó)專利No.4,308,399描述了適于治療糖尿病性血管病的式I化合物中的羥肟酸衍生物。
匈牙利專利HU-P No.207 988和其等同的歐洲專利EP No.417210也描述了式I化合物中具有選擇性β阻滯作用，因而適于治療糖尿病性血管病的羥肟酸鹵化物。
匈牙利專利申請(qǐng)No.2385/92(公開號(hào)No.T/66350)描述了式I化合物中的另外一些羥肟酸衍生物。這些已知的化合物可用于治療血管變形，主要是治療糖尿病。
已知人細(xì)胞的核基因組編碼大約100,000個(gè)基因，但細(xì)胞漿中也有小的獨(dú)立的線粒體基團(tuán)組(Wellace，D.C.，科學(xué)(Science)256，628-632(1992))。
線粒體基因組只編碼13個(gè)基因(Clayton，D.A.，細(xì)胞(Cell)28，693-705(1982))，但如果沒(méi)有它們細(xì)胞就不能消耗氧，因而在線粒體基因組受損時(shí)便使細(xì)胞處于無(wú)氧狀態(tài)。與核基因組不同的是，線粒體基因組并沒(méi)有DNA修復(fù)能力，而且線粒體DNA(mt DNA)沒(méi)有組蛋白包繞，從而使線粒體基因比核編碼的基因更易受損傷(Tzagoloff，A，Myer，A.M.，生化年鑒(Annu.Rev.Biochem.)，55，249-285(1986))。細(xì)胞耗氧的90％以上發(fā)生在線粒體內(nèi)膜中，其中除正常氧化作用外還形成氧游離基(Stryer，L.，生物化學(xué)(Biochemistry)，第四版，W.H.Freeman and Co.，New York，1995)。這些游離基很容易改變?cè)谄湫纬商幐浇木€粒體DNA。例如局部缺血后的再氧化(reoxigenation)期間，反應(yīng)性氧游離基的形成顯著增加，這種游離基濃度增加會(huì)導(dǎo)致對(duì)線粒體DNA的明顯地和不可逆地?fù)p傷(Marklund，S.L.，J.Mol.Cell.Cardiol.20(增刊II)，23-30(1988))。即使在正常環(huán)境下，游離基也可對(duì)mtDNA造成小的但累加的損傷。因此可以理解到，對(duì)mtDNA的損傷將隨年令增大而增加(Wellace，DC.，生化年鑒，61，1175-1212(1992))，但這種損傷還因個(gè)體而異，而且可在年長(zhǎng)者體內(nèi)造成心肌病和神經(jīng)退化性疾病(Cortopassi，G.A.，Arndeim，N.，核酸研究(NucleicAcid Res.)，18，6027-6033(1990))。
對(duì)線粒體基因組的損傷可通過(guò)對(duì)細(xì)胞能量代謝的損害引起例如肌病(Luft，R.，美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，91，8731-8738(1994))，擴(kuò)張性或肥厚性心肌病(Ozawa，T.等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，170，830-836(1990))等嚴(yán)重疾病；另外這種損傷在許多神經(jīng)退化性疾病(如巴金森氏病、杭延頓氏病、阿爾茨海默氏病)及重癥糖尿病隨年令增長(zhǎng)而惡化過(guò)程中可能起作用(Luft.R.，文獻(xiàn)出處同上)。
已應(yīng)用抗氧劑治療(如用輔酶Q和維生素C)治療上述多種疾病(如肌病)(Shoffner，J.M.，Wallace，D.C.，Adv.Hum.Genet.，19，267-330(1990))。但這些治療方法只是偶而有效。另外使用硫辛酰胺，以抗氧劑和代謝療法進(jìn)行試驗(yàn)治療，以避免局部缺血后的再氧化損傷。硫辛酰胺一方面通過(guò)其抗氧劑作用，另一方面借助其對(duì)線粒體代謝的積極影響來(lái)糾正因局部缺血所致的心臟損傷(Sumegi，Balazs等，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)，297，109-113(1994))。由于沒(méi)有關(guān)于損傷過(guò)程的深入了解，因而尚沒(méi)有治療方法上的突破性進(jìn)展。
基于上述事實(shí)，有必要開發(fā)一種可保護(hù)線粒體基因組免受損傷或者進(jìn)一步阻止這些損傷的醫(yī)藥產(chǎn)品。
已發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)式I的化合物能夠保護(hù)線粒體基因組免受損傷，因而適于保護(hù)線粒體基因組和/或線粒體免受損傷，或適用于治療與這些損傷相關(guān)的疾病。線粒體起源的疾病包括KSS(Kechs-Sayre氏綜合癥)MERRF(肌陣攣性癲癇和流行性紅纖維綜合癥)LHON(萊伯氏家族遺傳性視神經(jīng)萎縮)MELAS(線粒體性肌病、腦病、乳酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作)賴氏病CPEO(慢性進(jìn)行性外phthalmophegia)Alper氏綜合癥。
線粒體基因組受損的年令依賴性退化性疾病的例子有神經(jīng)退化性疾病阿爾茨海默氏病，帕金森氏病ALS(肌萎縮性側(cè)索硬化)，HD(杭廷頓氏病)，心肌病及其他肌病。
因此，本發(fā)明涉及含有0.1％至95％(質(zhì)量)作為活成分的式I羥肟酸衍生物或其藥上可接受的酸加成鹽，并混有一種或多種常規(guī)載體的藥物組合物。
在說(shuō)明書和權(quán)利要求中，C1-5烷基例如可以是甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基或正戊基，優(yōu)選的是甲基或乙基。
C3-8環(huán)烷基例如是環(huán)丙基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基或環(huán)辛基，優(yōu)選的是環(huán)戊基或環(huán)己基。
含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的5至8元環(huán)例如可以是吡咯、吡唑、咪唑、惡唑、噻唑、吡啶、噠嗪、嘧啶、哌嗪、嗎啉、吲哚、喹啉環(huán)等。
C1-24烷氧基例如可以是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、叔丁氧基、正戊氧基、癸氧基、十二烷氧基、十八烷氧基等。
C1-25烷?；缡羌柞；?、乙酰基、丙?；?、丁酰基、己酰基、十六?；⒂仓；取?br> C3-9烯?；缡潜?、戊烯酰、己烯酰、庚烯酰、辛烯酰等。
Cl-4亞烷基例如是亞甲基、亞乙基、亞丙基或亞丁基。
鹵原子例如是氟、氯、溴或碘原子，較好是氯或溴原子。
如果Y代表式R7-COO-的基團(tuán)，其可代表例如亞麻酰、亞油酰、二十二碳六烯酰、二十碳五烯酰、花生四烯酰等基團(tuán)。
式I化合物的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽是與藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、硫酸等，或與藥學(xué)上可接受的有機(jī)酸例如乙酸、富馬酸、乳酸等形成的酸加成鹽。
優(yōu)選的式I化合物亞組由下列結(jié)構(gòu)式的羥肟酸衍生物組成
其中R1、R2、R3、R4、R5、m和n具有如式I中指出的定義，X代表鹵原子或氨基，X代表羥基。
特別優(yōu)選的式II化合物是其中R1和R2連同它們所連接的氮原子一起形成哌啶子基，R3代表吡啶基、m和n為0、X定義同上的化合物。這些化合物中，優(yōu)選的是O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)吡啶-3-基羥肟酸氯化物(化合物“A”)，和O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)煙酸偕胺肟(化合物“B”)。
更優(yōu)選的式I羥肟酸衍生物亞組由下列結(jié)構(gòu)式的化合物組成
其中R1、R2、R3和A定義如式I中所述。另一個(gè)式I羥肟酸衍生物的優(yōu)選亞組由下列結(jié)構(gòu)式的化合物組成
其中R1、R2、R3和A具有如式I中指出的定義，Z代表氧或氮原子。
再一個(gè)式I羥肟酸衍生物的優(yōu)選亞組由下列結(jié)構(gòu)式的化合物組成
其中R1、R2、R3和A定義同式I化合物所述，R6代表C1-4烷基。
可按照匈牙利專利No.177578和207988以及匈牙利專利申請(qǐng)No.T/66350中所述方法制備式I的化合物。
本發(fā)明的藥物組合物包含作為活性成分的0.1％至95％(質(zhì)量)，較好1至50％(質(zhì)量)，最好5至30％(質(zhì)量)的式I羥肟酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽及一種或多種常規(guī)載體。
本發(fā)明的藥物組合物適于口服、胃腸道外或直腸給藥，或用于局部治療，并且可以是固體或液體的。
適于口服給藥的固體藥物組合物可以是粉末、膠囊、片劑、包膜片劑、微膠囊等，并可包含作為載體的諸如明膠、山梨醇、聚(乙烯吡咯烷酮)等粘結(jié)劑；諸如乳糖、葡萄糖、淀粉、磷酸鈣等填充劑；硬脂酸鎂、滑石粉、聚(乙二醇)、二氧化硅等壓片輔助物質(zhì)；十二烷基硫酸鈉等潤(rùn)濕劑。
適于口服給藥的液體藥物組合物可以是溶液、懸液或乳液，并可包含作為載體的明膠、羧甲基纖維素等懸浮劑；脫水山梨醇單油酸酯等乳化劑；水、油、丙二醇、乙醇等溶劑；對(duì)羥基甲酸甲酯等防腐劑。
適于胃腸道外給藥的藥物組合物一般由活性成分的無(wú)菌溶液組成。
上述劑型及其他一些劑型都是已知的，例如參見(jiàn)Remington’sPharmaceutical Science，第18版，Mack出版公司，美國(guó)Easton(1990)。
本發(fā)明的藥物組合物一般含有單位劑量。成年病人每日劑量一般為0.1至1000mg式I化合物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。上述劑量可分一次或幾次給藥。實(shí)際劑量將取決于許多因素并可由醫(yī)生來(lái)決定。
為制備本發(fā)明的藥物組合物，可將式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽與一種或多種載體相混合，并將所得到的混合物按已知方式轉(zhuǎn)化成藥物組合物。適用的方法例如可參見(jiàn)Ramington’s PharmaceuticalSciences。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案包括式I化合物(其中R、R1、R2、R3、X、Y、A和B具有式I中指出的定義)或藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，及任選與之混合的一種或多種藥物組合物中常用的載體，在制備用于保護(hù)線粒體基因組和/或線粒體免受損傷的藥物組合物中的用途。
本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案包括式I化合物(其中R、R1、R2、R3、X、Y、A和B具有式I中指出之定義)或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，及比窩與之混合的一種或多種藥物組合物中常用的載體，在制備用于治療與線粒體基因組和/或線粒體損傷相關(guān)聯(lián)之疾病的藥物組合物中的用途。這些疾病特別包括肌病、心肌病及神經(jīng)退化性疾病，例如阿爾茨海默氏病、帕金森氏病或杭廷頓氏病。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，使用其中R1、R2、R3、R4、R5、X、Y、m和n具有式II所述定義的式II的羥肟酸衍生物，或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案，使用其中R1和R2連同它們所連接的氮原子形成哌啶子基，m和n為0，X和Y具有式II所述定義的式II的化合物，或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的方案，使用O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)吡啶-3-基羥肟酸氯化物或O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)煙酸偕胺肟或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
體外試驗(yàn)根據(jù)式I的羥肟酸衍生物體外保護(hù)氧化磷酸化的能力來(lái)檢驗(yàn)它們的線粒體基因組保護(hù)作用。試驗(yàn)的理論基礎(chǔ)是細(xì)胞所需的能量是由在線粒體中合成的三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生的。底物運(yùn)輸、檸檬酸代謝途徑的異常改變、呼吸復(fù)合物的缺陷及氧化磷酸化的中斷使細(xì)胞的能量供應(yīng)紊亂。試驗(yàn)中，對(duì)釀酒酵母細(xì)胞和K562人紅白血病細(xì)胞進(jìn)行熱休克處理以損傷其氧化磷酸化作用，并檢測(cè)化合物“B”的保護(hù)效果。
已知熱休克的一種損傷作用是立刻即在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生的，通過(guò)中斷氧化磷酸化的呼吸鏈而影響線粒體。使用化學(xué)解偶聯(lián)劑所作的試驗(yàn)顯示，在電子傳遞期間，由呼吸鏈的酶復(fù)合物泵入線粒體內(nèi)膜和外膜之間的質(zhì)子，由于受到解偶聯(lián)劑的作用而又回到內(nèi)部空間，因而不能合成ATP。由于熱休克，發(fā)生了一個(gè)導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)迅速減少的相似過(guò)程。
試驗(yàn)中使用的材料釀酒酵母細(xì)胞培養(yǎng)物。將S288C單倍體野生型細(xì)胞系培養(yǎng)于含有1％酵母提取物、2％蛋白胨和3％甘油的YPG培養(yǎng)基中。于有氧條件下，在25℃水浴中振蕩液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物。
K562培養(yǎng)物將人慢性髓樣白血病來(lái)源的K562紅白血病型細(xì)胞系培養(yǎng)在37℃和含95％空氣和5％ CO2的濕混合氣體環(huán)境下，含10％小牛血清的RPMI1640液體培養(yǎng)基中。
寡霉素(Olig)氰化羰基間氯苯基腙(C-CCP，美國(guó)圣路易絲Sigma化學(xué)公司生產(chǎn))。
按下述方法檢測(cè)氧耗量在細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)離心細(xì)胞，在使用釀酒酵母時(shí)，將細(xì)胞懸浮在10倍量含1％甘露糖而不是2％甘油的YPG培養(yǎng)基中。在使用K562細(xì)胞時(shí)，分離后在含20mM HEPES的RPMI 1640培養(yǎng)基中制成濃度為4×106細(xì)胞/ml的懸液。在2ml恒溫小杯中用Clare氏電極測(cè)定氧耗量。詳細(xì)方法參見(jiàn)Patriarca，E.J.和Maresca，B.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究(ExperimentalCell Resarch)，196，57-64(1990)。使用下列公式計(jì)算對(duì)呼吸速率的刺激作用[(VC1-CCP/VOlig)-1]×100在分離后熱休克前一小時(shí)分別向培養(yǎng)基內(nèi)加入10-5、2.5×10-5、5×10-5M化合物“B”和溶劑(含有磷酸鹽緩沖劑的生理氯化鈉溶液)。將培養(yǎng)物于42℃下而不是原來(lái)的25℃下保持5分鐘進(jìn)行熱休克處理。對(duì)于K562細(xì)胞，則將培養(yǎng)物置于48℃下而不是原來(lái)的37℃保持10分鐘。
實(shí)驗(yàn)期間已注意到，對(duì)于釀酒酵母和K562細(xì)胞，熱休克都明顯地解除了電子傳遞鏈與ATP合成間的偶聯(lián)。
所得結(jié)果示于表1和2中，其中給出了處理方法及百分刺激作用和所得到的百分保護(hù)率。
表1對(duì)釀酒酵母的氧化磷酸化的保護(hù)作用處理刺激作用(％)保護(hù)作用(％)25℃ 99±1342℃+溶劑 8±2 042℃+1×10-5M33±527化合物“B”42℃+2.5×10-5M 47±443化合物“B”42℃+5×10-5M43±538化合物“B”
表2對(duì)K562的氧化磷酸化的保護(hù)作用處理 刺激作用(％)保護(hù)作用(％)37℃ 117±2248℃+溶劑 27±3048℃+1×10-5M 70±836化合物“B”48℃+2.5×10-5M 95±11 57化合物“B”48℃+5×10-5M 97±11 58化合物“B”表1和2所示的數(shù)據(jù)證明，應(yīng)用化合物“B”可阻止線粒體呼吸復(fù)合物解偶聯(lián)，進(jìn)而增加對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。
在試驗(yàn)范圍內(nèi)，化合物“B”的最適濃度為25μM。除了維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞功能外，其最可能的直接作用是阻止氧游離基的形成。據(jù)此我們可以認(rèn)為，化合物“B”提供了抗線粒體基因組損傷的保護(hù)作用。
防止線粒體遭受熱誘導(dǎo)的解偶聯(lián)正常情況下，在NADH氧化期間呼吸復(fù)合物泵出的質(zhì)子在線粒體內(nèi)膜兩側(cè)造成質(zhì)子梯度。該質(zhì)子梯度為從ADP和無(wú)機(jī)磷酸合成ATP提供能量。質(zhì)子只能利用從ADP和無(wú)機(jī)磷酸(Pi)合成ATP所需的質(zhì)子梯度能量，通過(guò)F1F0ATP酶重新進(jìn)入內(nèi)膜空間。在沒(méi)有ADP或Pi的情況下，質(zhì)子梯度增加，并抑制呼吸復(fù)合物和線粒體氧耗量。然而，如果線粒體內(nèi)膜有損傷，則質(zhì)子可能通過(guò)受損傷區(qū)域重新進(jìn)入內(nèi)膜間隙，質(zhì)子梯度的能量未被F1F0ATP酶利用，從而線粒氧化即變得不再依賴于ADP(線粒體解偶聯(lián))。
已經(jīng)知道，熱應(yīng)激可誘導(dǎo)線粒體氧化作用與線粒體能量(ATP)產(chǎn)生之間的解偶聯(lián)，這是熱應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜損傷的結(jié)果。在受損的膜區(qū)域，質(zhì)子從膜間間隙漏失到膜內(nèi)部分，從而使成粒體氧化成為不依賴ADP的過(guò)程。
為進(jìn)行試驗(yàn)，從對(duì)照大鼠或預(yù)先用40mg/kg化合物“B”處理6小時(shí)的大鼠細(xì)胞中分離線粒體(制備方法參見(jiàn)Sumegi等，生物化學(xué)雜志，259，8748(1984))。在37℃小室中用Clark電極測(cè)定氧耗量。測(cè)定有5mM ADP和沒(méi)有ADP存在下的氧耗量比例，并將對(duì)未處理的線粒體和于42℃預(yù)處理8分鐘的線粒體的檢測(cè)結(jié)果示于表3中。
表3抗線粒體的熱誘導(dǎo)解偶聯(lián)的保護(hù)作用處理線粒體無(wú) 43℃下8分鐘存在ADP對(duì)不存在條件下的線粒體氧耗量比例對(duì)照物6±0.82.7±1.1化合物“B”處理的動(dòng)物 6.2±1.0 5.0±1.2所示數(shù)據(jù)為三次實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
從表3中可以看出，在正常條件下，有ADP存在時(shí)比在無(wú)ADP培養(yǎng)基中的線粒體氧化作用大約快6倍，表明線粒體氧化與ATP合成之間有很好的偶聯(lián)關(guān)系。但熱應(yīng)激顯著地降低了線粒體的偶聯(lián)，并且在對(duì)照組中該值也有所降低(2.7)，但用化合物“B”預(yù)處理之動(dòng)物的線粒體中則仍保持相對(duì)較高的偶聯(lián)比例(5.1)。這些數(shù)據(jù)表明，式I的化合物，特別是化合物“B”可保護(hù)線粒體能量產(chǎn)生(ATP合成)免于遭受熱應(yīng)激引起的損傷。
保護(hù)膽堿能神經(jīng)元免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞退化已知過(guò)氧化氫通過(guò)在細(xì)胞中產(chǎn)生氧相關(guān)游離基引起氧化性細(xì)胞損傷。因此，可使用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作為神經(jīng)元退化的通用模型。使用SN6.10.2.2雜種，N18TG2+ED15間隔神經(jīng)元細(xì)胞系(Hammond等，科學(xué)234，1237(1986))研究式I化合物對(duì)抗氧相關(guān)游離基引起之細(xì)胞損傷(其為大多數(shù)神經(jīng)退化性疾病的主要途徑)的保護(hù)作用。
為此，將細(xì)胞在96孔平板上分成兩組。一組維持在含化合物“B”的培養(yǎng)基中，另一組則維持在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。分組后24小時(shí)開始處理。兩組均用其含有不同濃度過(guò)氧化氫的培養(yǎng)基處理。處理48小時(shí)后進(jìn)行存活試驗(yàn)。
存活試驗(yàn)從小孔中除去培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS洗細(xì)胞，然后向各孔內(nèi)加入溶于150μg新鮮二乙胺緩沖液(pH9.8)中的150μg堿性磷酸酶底物。于30℃下保溫平板，并向各孔內(nèi)加入50μl氫氧化鈉以終止反應(yīng)。用DynatechELISA讀數(shù)器測(cè)出405nm處吸光值，并將只含有培養(yǎng)基的各平板外圍孔作為進(jìn)行本底檢測(cè)的空白對(duì)照。
結(jié)果示于表4中。
表4化合物“B”保護(hù)膽堿能神經(jīng)元免受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用培養(yǎng)基含化合物“B”培養(yǎng)基對(duì)照組 100％100％60mM H2O211±2％ 63±4％120mM H2O28±3％ 52±5％表4顯示，所試驗(yàn)的式I化合物可有效地保護(hù)膽堿能神經(jīng)元免于遭受過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用。因?yàn)檫^(guò)氧化氫通過(guò)產(chǎn)生大量氧相關(guān)游離基殺死細(xì)胞，所以化合物“B”可保護(hù)那些與氧相關(guān)游離基有關(guān)的神經(jīng)元損傷性疾病中的神經(jīng)元。因此，式I的化合物可能對(duì)于帕金森氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、杭廷頓氏病及混合來(lái)源的癡呆(生命科學(xué)(Life Science)56，1151-1171(1995))有利。
體內(nèi)試驗(yàn)還在處理的大鼠體內(nèi)試驗(yàn)了式I的羥肟酸衍生物的線粒體基因組保護(hù)作用。以50mg/kg的劑量每天用AZT(3’-疊氮胸苷，Sigma化學(xué)公司生產(chǎn))處理Vistar大鼠，共14天。某些試驗(yàn)組合用AZT和化合物“A”(每天20mg/kg)或化合物“B”(每天40mg/kg)處理動(dòng)物。處理期間和處理后進(jìn)行各種檢測(cè)。
1)在動(dòng)物的所有四肢上用Schiller AT-6 ECG監(jiān)測(cè)其心臟功能。使用技術(shù)文獻(xiàn)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法估計(jì)ECG參數(shù)(Kawai C.，Takatsu，T.，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New Engl.J.Med.)，293，592(1975)；Augelakos，E.T.，Bernardini，P.J. Appl.Physiol.，18，261-262(1963))。我們已確定了RR、PR和TQ間隔區(qū)及J點(diǎn)降低。結(jié)果示于表5中，數(shù)值為5次檢測(cè)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
表5化合物“B”對(duì)AZT誘導(dǎo)的心功能失常(心肌病)的影響處理 RR PR QT(ms) J(mm)處理前 174±12 53±2 70±2 -0.1±0.1每天50mg/kg AZT284±16 82±3 112±9 -1.1±0.1處理14天每天50mg/kg AZT161±24 47±6 76±5 -0.2±0.14和40mg/kg化合物“B”處理14天表5所示的數(shù)據(jù)證明，與對(duì)照組相比，AZT處理使動(dòng)物的心率明顯延長(zhǎng)(RR)，而且使PQ間隔增加。此外，發(fā)現(xiàn)QT值顯著增加，并且在代表左心室主要肌肉質(zhì)量的I和VL導(dǎo)程中出現(xiàn)有意義的J點(diǎn)下降(超過(guò)0.1mV)。這些參數(shù)表明了心肌缺血和缺陷性氧消耗的特征。但在除了使用AZT外，同時(shí)還給大鼠每天投用40mg/kg劑量的化合物“B”時(shí)，可見(jiàn)動(dòng)物心電圖參數(shù)恢復(fù)正常，這表明該化合物可保護(hù)心臟免于遭受AZT誘發(fā)的功能異常。
2)檢測(cè)動(dòng)物的呼吸活動(dòng)。如此確定NADH的活生使用技術(shù)文獻(xiàn)中描述的方法(Sumegi，Balazs，Clin.Chim.Acta.，192，9-18(1990))測(cè)定細(xì)胞色素C氧化還原酶、細(xì)胞色素氧化酶和檸檬酸合成酶。(NADH煙酸腺嘌呤二核苷酸，還原態(tài))。結(jié)果示于表6中。
表6化合物“A”和“B”對(duì)AZT誘導(dǎo)的呼吸活動(dòng)降低的影響處理 細(xì)胞色素氧化酶 NADH細(xì)胞色素 檸檬酸合成氧化還原酶 酶(單位/克濕組織)對(duì)照組 14.7±1.611.6±±0.7 292±28AZT8.7±2 9.5±0.2242±19AZT+化合物“A”10.3±1.211.3±0.5 262±47AZT+化合物“B”11.8±1.310.5±1 271±11表6所示數(shù)據(jù)充分證明，AZT處理顯著降低心臟線粒體中呼吸復(fù)合物的活性。這樣，AZT顯著地降低心臟中的氧化能量產(chǎn)生，致使心臟處于不能徹底完成其基本功能的狀態(tài)(參見(jiàn)表5，ECG數(shù)據(jù))。此外，線粒體呼吸能力的降低可導(dǎo)致異常的線粒體代謝，進(jìn)而可引起心臟損傷。
當(dāng)給動(dòng)物聯(lián)合投用AZT和化合物“A”或“B”時(shí)，其呼吸活動(dòng)降低效應(yīng)幾乎消失，而且呼吸活動(dòng)值接近于正常。即式I的被試化合物通過(guò)保護(hù)呼吸復(fù)合物而明顯降低了AZT誘導(dǎo)的線粒體膜損傷。
3)檢查對(duì)線粒體基因組的損傷。應(yīng)用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法檢測(cè)對(duì)線粒體基因組的損傷。經(jīng)擴(kuò)增從細(xì)胞色素氧化酶成分I到細(xì)胞色素B范圍的序列來(lái)選擇引物，以尋找缺失(引物購(gòu)自Ransonhill BioscienceCo.)。在Sunegi，Balazs等人的出版物(B.B.A.(1996))中描述了所使用的方法。使用擴(kuò)增線粒體基因組的4929至16298區(qū)域的PCR引物，顯示AZT處理的大鼠中0.5和1.5kb范圍被顯著擴(kuò)增。同時(shí)，在對(duì)照組動(dòng)物則沒(méi)有看到這種短范圍的擴(kuò)增。可以理解到，未受損傷的基因組并不擴(kuò)增短的DNA區(qū)域，因?yàn)樵谶@些試驗(yàn)中引物相互間都在11.3kb以上。在AZT處理的大鼠中擴(kuò)增了這種短的DNA范圍這一事實(shí)表明，由于AZT處理，使線粒體基因組中缺失10kb區(qū)域，而且在受損傷的基因且中引物彼此逐漸接近到0.5-1.5kb。因此，這樣的DNA范圍可被擴(kuò)增。這樣的DNA范圍的擴(kuò)增表明對(duì)線粒體基因組的損傷，即編碼細(xì)胞色素氧化酶之亞組I、II和III的基因、編碼ATP 6和8的基因、編碼復(fù)合物I或HADH輔酶Q氧化還原酶2、4、4L、5和6的基因、以及編碼細(xì)胞色素B的基因部分或全部缺失。
當(dāng)給動(dòng)物聯(lián)合投用AZT和化合物“B”時(shí)，上述短DNA范圍的擴(kuò)增已顯著減少并且不能檢測(cè)到某些DNA片段。
這就意味著化合物“B”保護(hù)了上述DNA免于遭受AZT誘導(dǎo)的損傷，或至少顯著降低了那些損傷。應(yīng)提到的是，AZT誘導(dǎo)的對(duì)上述基因的人工損傷也可能因局部缺血性心肌病或年長(zhǎng)病人的心肌病而發(fā)生。
式I化合物對(duì)遺傳性線粒體心肌病的影響。
使用遺傳性線粒體心肌病大鼠進(jìn)行試驗(yàn)，每天以40mg/kg劑量的化合物“B”處理14天。以ECG監(jiān)測(cè)大鼠的心臟功能。表7中顯示了對(duì)照組和用化合物“B”處理組動(dòng)物的ECG數(shù)據(jù)。其中數(shù)值是作為3次檢測(cè)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差給出的。
表7化合物“B”對(duì)遺傳性線粒體心肌病大鼠的心臟功能的影響處理 RR PR QT(ms) J(mm)對(duì)照組 204±2054±592±8-1.0±0.1化合物“B”169±2143±771±7-0.3±-0.1對(duì)心臟功能異常的患遺傳性心肌病大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。從表7中可以很容易地看到這一事實(shí)。這些心肌病大鼠可以作為局部缺血性心肌病和年長(zhǎng)者心肌病的理想模型。由于因化合物“B”進(jìn)行14天處理的作用，使動(dòng)物的心臟功能明顯改善，并且ECG參數(shù)也回復(fù)到正常范圍。
上述這些試驗(yàn)顯示，式I的羥肟酸衍生物能夠保護(hù)線粒體基因組對(duì)抗各種損傷。就所使用的動(dòng)物模型來(lái)說(shuō)，它們最后消除了AZT誘導(dǎo)的心臟損傷，考慮到目前全世界有上百萬(wàn)用AZT治療的病人，因而它們可以在人類醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重大作用。
這些化合物的再一個(gè)重要特點(diǎn)是，在顯現(xiàn)心肌病的病例中(其中線粒體損傷相似于局部缺血性心肌病和年長(zhǎng)者心肌病的線粒體損傷)，它們可消除心臟功能異常并恢復(fù)正常ECG參數(shù)。
基于上述試驗(yàn)，可以說(shuō)本發(fā)明的含有式I化合物(作為活性成分)的藥物組合物可保護(hù)線粒體基因組或線粒體免受損傷，進(jìn)而可用于治療已顯現(xiàn)了這種類型損傷的疾病。
權(quán)利要求
1.用于保護(hù)線粒體基因組和/或線粒體免受損傷或治療與這些損傷相關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物，該組合物含有0.1至95％(質(zhì)量)與一種或多種常規(guī)載體混合的作為活性成分的下式的羥肟酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽
其中R1代表氫或C1-5烷基，R2代表氫、C1-5烷基、C3-8環(huán)烷基或可被羥基或苯基取代的苯基；或者R1和R2與它們所連接的氮原子一起形成5至8元環(huán)，該環(huán)還可另外含一個(gè)或多個(gè)氮、氧或硫原子，并且所說(shuō)的環(huán)可與另一個(gè)脂環(huán)或雜環(huán)縮合，優(yōu)選與苯、萘、喹啉、異喹啉、吡啶或吡唑啉環(huán)，如果需要且化學(xué)上可能時(shí)，氮和/或硫雜原子以氧化物或二氧化物的形式存在，R3代表氫、苯基、萘基或吡啶基，其中所說(shuō)的基團(tuán)可以被一個(gè)或多個(gè)鹵原子或C1-4烷氧基取代，Y是氫、羥基、可被氨基取代的C1-24烷氧基、含有1至6個(gè)雙鍵的C2-24多烯氧基、C1-25烷?；?、C3-9烯?；蚴絉7-COO-的基團(tuán)，其中R7代表含有1至6個(gè)雙鍵的C2-30多烯基，X代表鹵素、氨基、C1-4烷氧基，或者X與B形成氧原子，或者X和Y與它們所連接的碳原子以及所說(shuō)碳原子之間的-NR-O-CH2基團(tuán)一起形成有下列結(jié)構(gòu)式的環(huán)
其中Z代表氧或氮，R代表氫或R與B形成化學(xué)鍵，A是C1-4亞烷基或化學(xué)鍵或有下列結(jié)構(gòu)式的基團(tuán)
其中R4代表氫、C1-5烷基、C3-8環(huán)烷基或可被鹵素、C1-4烷氧基或C1-5烷基取代的苯基，R5代表氫、C1-4烷基或苯基，m為0、1或2，n為0、1或2。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中活性成分是具有下列結(jié)構(gòu)式的化合物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽
其中R1、R2、R3、R4、R5、m和n具有權(quán)利要求1中指出的定義，X代表鹵素或氨基，Y代表羥基。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中活性成分是具有下列結(jié)構(gòu)式的化合物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽
其中R1、R2、R3和A具有權(quán)利要求1中指出的定義。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中活性成分是具有下列結(jié)構(gòu)式的化合物，或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽
其中R1、R2、R3和A具有權(quán)利要求1中指出的定義，Z代表氧或氮原子。
5.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中活性成分是具有下列結(jié)構(gòu)式的化合物或其醫(yī)學(xué)上可接受的鹽
其中R1、R2、R3和A具有權(quán)利要求1中指出的定義，R6代表C1-4烷基。
6.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中活性成分是結(jié)構(gòu)式II的化合物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽，該式中R1和R2連同它們所連接的氮原子一起形成哌啶子基，m和n為0，X和Y具有權(quán)利要求2中指定的定義。
7.權(quán)利要求1、2或6的藥物組合物，其中活性成分是O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)吡啶-3-基羥肟酸氯化物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
8.權(quán)利要求1、2或6的藥物組合物，其中活性成分是O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)煙酸偕胺肟或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
9.式I化合物-其中R1、R2、R3、X、Y、A和B具有權(quán)利要求1中所述定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽可與常規(guī)用于藥物組合物中的一種或多種載體混合用于制備具有保護(hù)線粒體基因組和/或線粒體免受損傷之活性的藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中使用式II的化合物-其中R1、R2、R3、R4、R5、X、Y、m和n具有如權(quán)利要求2中指出的定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中使用式III的化合物-其中R1、R2、R3和A具有如權(quán)利要求3中指出的定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中使用式IV的化合物-其中R1、R2、R3、A和Z具有如權(quán)利要求4中指出的定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，其中使用式V的化合物-其中R1、R2、R3、R6和A具有如權(quán)利要求5中指出的定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
14.根據(jù)權(quán)利要求9或10的應(yīng)用，其中，式II化合物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的取代基R1和R2與它們所連接的氮原子一起形成哌啶子基，m和n的值為0，而X和Y具有如權(quán)利要求2中指出的定義。
15.根據(jù)權(quán)利要求9、10或14的應(yīng)用，其中式I或II的化合物是O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)吡啶-3-基羥肟酸氯化物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
16.根據(jù)權(quán)利要求9、10或14的應(yīng)用，其中式I或II的化合物是O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)煙酸偕胺肟或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
17.結(jié)構(gòu)式I的化合物-其中R1、R2、R3、X、Y、A和B具有權(quán)利要求1中所述定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽可與常規(guī)用于藥物組合物中的一種或多種載體混合于制備治療與線粒體基因組和/或線粒體損傷相關(guān)聯(lián)之疾病的藥物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所說(shuō)的藥物用于治療肌病和/或心肌病。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的應(yīng)用，其中所說(shuō)的藥物用于治療神經(jīng)退化性疾病，特別是阿次茨海默氏病，帕金森氏病或杭廷頓氏病。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用式II的化合物-其中R1、R2R3、R4、R5、X、Y、m和n具有如權(quán)利要求2中指出的定義-或其藥學(xué)上可接受的鹽。
21.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用式III的化合物-其中R1、R2、R3和A具有如權(quán)利要求3中指出的定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
22.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用式IV的化合物-其中R1、R2、R3、A和Z具有如權(quán)利要求4中指出的定義-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
23.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用式V的化合物-其中R1、R2、R3、R6和A為權(quán)利要求5中指出的相同的取代基-或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
24.根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中式II化合物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的取代基R1和R2與它們所連接的氮原子一起形成哌啶子基，m和n的值為0，而X和Y為權(quán)利要求2中指出的基團(tuán)。
25.根據(jù)權(quán)利要求17至20和24中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中式I或II的化合物是O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)吡啶-3-基羥肟酸氯化物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
26.根據(jù)權(quán)利要求17至20和24中任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中式I或II的化合物是O-(3-哌啶子基-2-羥基-1-丙基)煙酸偕胺肟或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及適于保護(hù)線粒體基因組和/或線粒體免受損傷或治療與這種損傷相關(guān)聯(lián)的疾病的藥物組合物,所說(shuō)的組合物含有式(Ⅰ)的羥肟酸衍生物或其藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。
文檔編號(hào)A61P25/28GK1200670SQ9619780
公開日1998年12月2日 申請(qǐng)日期1996年9月26日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月29日
發(fā)明者P·利特蒂納吉, B·素米吉, L·維格, B·馬里斯卡 申請(qǐng)人:梅德根有限公司