專利名稱：Stat－1－依賴性基因的表達調(diào)控的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO1至43的核酸序列的誘餌寡核苷酸(decoy-oligonucleotide)和反義寡核苷酸(antisense-oligonucleotide)以及這些寡核苷酸作為藥物的用途。
現(xiàn)有技術人類基因組解密的一項主要目標在于分別鑒定出致病基因(由于其產(chǎn)物之作用方式所致)與此類基因所具結構的致病性變化(多形現(xiàn)象)，并將其歸類到一種疾病模式。所以，對于大部份的疾病，若其被認定為由一經(jīng)確定數(shù)目的基因產(chǎn)物表達得太強、太弱或缺陷所引起時，就會達到由原因所決定的治療法。事實上，對于一組遺傳疾病(例如囊性纖維化)就已經(jīng)知道通常為單一基因缺陷(單基因性疾病)，而對于其他疾病(例如高血壓)則顯得明顯更為復雜。后者顯然地不是單一而是多重基因缺陷的結果(多基因性疾病)，預先確定了罹患者會發(fā)展出與某些環(huán)境因素吻合的疾病。盡管此事實會限制對于在一或多重基因的表達中的目標導向性介入，卻也為一種基于原因而非僅僅基于癥狀的治療法提供了一個契機。
轉錄因子為DNA-結合蛋白質，其會結合到在細胞核內(nèi)部一或多重基因的啟動子區(qū)，由此調(diào)節(jié)基因的表達，亦即這些基因所編碼的蛋白質的產(chǎn)生。除了控制人體內(nèi)發(fā)育和分化的過程的重要生理作用之外，轉錄因子也顯示出高度的誘發(fā)疾病之潛在性，特別是其會在錯誤的時間點活化基因表達。此外(可能為相同的)轉錄因子可能阻斷具有保護功能的基因而有使疾病易于形成。于此范圍內(nèi)，在下面所述抗-轉錄因子治療法的原理中，其目標系在致病性基因的抑制與相對的保護性基因之活化。
炎癥為生物體和其組織對抗損傷性刺激的一種防衛(wèi)反應，其目標在于該損傷的糾正或至少將其限制在局部，并消除掉損傷的誘因(例如入侵的細菌或外來物質)。炎癥的誘發(fā)物可能為微生物(細菌、病毒、真菌或寄生蟲)，外來物質(花粉、石棉或硅酸鹽結晶)，機械性損傷、化學有害因子和物理影響所致組織破壞，以及來自身體本身的誘發(fā)物(崩潰性腫瘤細胞、血管外血液、自身免疫性反應)或體內(nèi)沉淀物質的結晶(尿酸、草酸鈣和磷酸鈣、膽固醇)。
肥大細胞(組織內(nèi)部者)或血液內(nèi)的嗜堿性粒細胞等的快速活化即為觸發(fā)非常強的急性炎癥反應的一個例子，且為免疫學的速發(fā)型過敏反應(I型體液變態(tài)反應(humoral allergy type I)的特征。若生物體已經(jīng)在事先接觸到抗原(或于過敏性的情況中接觸到過敏原)，則B-淋巴細胞會被致敏作為對此的反應。B-淋巴細胞會與事先致敏的CD4-陽性2型T-輔助細胞(Th2細胞)配合而轉換成為漿細胞(plasmocyte)，且開始產(chǎn)生對抗抗原的IgE-型抗體。于此分化過程中，由表達出相應配體(CD154)的Th2細胞通過CD40-受體產(chǎn)生的B-淋巴細胞之共刺激具有關鍵重要性。當攜帶著抗原的IgE-抗體結合到肥大細胞上面的相應受體(Fcε型)時，這些細胞即開始釋放不同的炎癥介質，特別是組織胺、白介素-8、白三烯類、和腫瘤壞死因子-α(TNFα)。其結果為吸引專職的炎性細胞特別是嗜酸性(eosinophile)和嗜中性(neutrophile)粒細胞和單核細胞以及現(xiàn)場的T-淋巴細胞(趨化學性)。同時會發(fā)生組織胺依賴性血管擴張及覆蓋血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細胞的通透性之增加。由于血管擴張，流動速度的減低有助于在受吸引的白細胞與內(nèi)皮細胞之間建立物理接觸。暴露于細胞因子(例如TNFα)且由此被活化的這些內(nèi)皮細胞會顯示出選擇蛋白(selectin)(例如E-選擇蛋白)在其血管腔表面上的強化表達，促成白細胞沿著內(nèi)皮細胞滾動且由此使其他粘附分子(整聯(lián)蛋白(integrin)；例如細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1)[ICAM-1]或血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1)[VCAM-1])活化。至此白細胞可粘附到血管壁(邊緣化(margination))且組織胺-相關聯(lián)的通透性之增加(內(nèi)皮細胞聯(lián)結的松散)有利于其移動到血管外空間之內(nèi)(血球滲出)。于此同時，增加量的富蛋白質流體(炎性滲出液)達到間質空間而形成水腫。周遭的神經(jīng)末端會被組織內(nèi)增加的壓力與炎性細胞產(chǎn)生的其他介質所刺激并觸動疼痛而意識到組織的損傷。
已經(jīng)移動到炎癥部位的粒細胞與已經(jīng)再分化成巨噬細胞的單核細胞都嘗試分別通過吞噬作用和胞溶作用消除掉炎癥誘發(fā)因素，由此觸發(fā)蛋白水解酶和氧自由基等的釋放，而這也可能損傷周遭組織的。特別是巨噬細胞的活化可能從許多方面(例如進一步釋放細胞因子如白介素-1β和白介素-6)促成使得整個生物體參與了最初為局部的炎癥反應，這就是所謂的急性時相反應(acute phase reaction)。急性時相反應的代表性特性為疲勞、無精打采和發(fā)熱，白細胞從骨髓的釋放增加(白細胞增多)，在血液內(nèi)檢測到急性時相蛋白質(例如C-反應性蛋白質)，免疫系統(tǒng)的刺激以及因為改變后的新陳代謝狀態(tài)所致體重減低。
若炎癥的誘因可以消除時，傷口愈合的過程會與破壞組織的修復同步。最佳者為此過程會達到完整的再建立(完全恢復(restitutio adintegrum))，而更大的損傷或結締組織(尤其是膠原蛋白)的過度產(chǎn)生會導致瘢痕的形成，其可能伴隨著取決于受害組織的相當程度的功能障礙。若誘因(外來物質或傷口感染)不能一次消除掉，則傷口愈合會延緩，同時增加吞噬細胞的遷移和活性，造成組織的毀滅(壞死)到甚至于腔洞的形成(膿腫)。其結果幾乎總是有瘢痕的組織重建伴隨著相應的功能損失。若不能成功地將來源于誘因的炎癥限制在局部，則該炎癥會透過淋巴系統(tǒng)散布到整個生物體。其結果是可能有致命危險的敗血癥(感染性休克)。
若炎癥和痊愈過程呈平衡情況，傷口痊愈也會受到干擾。其結果為慢性炎癥，可能到制纖維化(過多膠原蛋白合成)或肉芽腫性(炎性細胞組織化成為肉芽組織)且時常會分別帶來受害組織的連續(xù)性破壞與其所具功能的逐步受限。
除了所述可能慢性進展的一般炎癥反應之外，炎性疾病還會針對根本的發(fā)病機理展現(xiàn)出一般表現(xiàn)與不同的差異。兩種這些類型的疾病為例如心臟手術介入之后的并發(fā)癥與免疫不相容性反應，因其具有巨大的臨床相關性而在本說明書中給予較多的篇幅。
以基于球囊插管的機械擴張(經(jīng)皮血管成形術)與利用靜脈搭橋的動脈粥樣硬化性狹窄化動脈搭橋術仍然分別構成患有冠狀動脈疾病與周圍循環(huán)疾病的患者之首選治療法以分別提供對抗即將發(fā)生的梗塞或器官衰竭之保護。不過經(jīng)過機械擴張與(在大部分情況中)使用金屬血管支撐器(支架(stent))處理的動脈之再堵塞(再狹窄)率顯然高得不可接受，于6個月內(nèi)達20-50％。此外，分別針對有關手術的風險背景與手術后的風險而論，主動脈冠狀動脈和周圍靜脈搭橋于5年之后50-70％的再堵塞率對于接受治療的患者則不僅是令人不滿而已。也許是因為血管壁的損傷(此處受影響者包括內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞)之故，血管成形術之后的再狹窄在早期階段別會顯示出一種明顯的炎癥反應成分，其特征為，與其他一起者，血管壁被專職炎性細胞所侵潤(主要為單核細胞和T-淋巴細胞)。在主動脈冠狀動脈與周圍靜脈搭橋之內(nèi)的纖維增生性狹窄形成(血管內(nèi)膜增殖(intimal hyperplasia))似乎也分別基于炎癥反應，特別是由機械和物理病因所引起者。長久以來就已經(jīng)知道在外科介入或器官移植范疇中的所謂缺血/再注入-相關性損傷會伴隨著以炎癥為基礎的組織損傷，其中在內(nèi)皮細胞與專職炎性細胞(主要為粒細胞不過也包括單核細胞和T-淋巴細胞)之間的相互作用以及組織損傷性物質(氧自由基，細胞因子)的釋放起著十分關鍵性作用。
關于所提及的心血管并發(fā)癥，重要的是要有保護機制，最重要的是在血管壁的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞之內(nèi)。其有助于限制炎癥反應的程度與隨后的組織之適應性重建。對此方面，舉例而言，有屬于在內(nèi)皮細胞內(nèi)的由NO-合成酶進行的一氧化氮(NO)之合成。NO，可能起著氧自由基超氧化物的內(nèi)源性拮抗劑之作用，因此，與其他一起者，會抑制促炎性細胞因子(例如，單核細胞趨化性蛋白質-1(monocyte chemoattractantprotein-1)(MCP-1)與粘附分子(例如ICAM-1)在內(nèi)皮細胞內(nèi)的表達，生長因子受體(例如內(nèi)皮素B-受體)在平滑肌細胞內(nèi)的表達以及生長因子從白細胞的釋放。如此，可以容易地了解者，機械性損傷就如內(nèi)皮的功能性損傷(例如在這些細胞內(nèi)由細胞因子誘發(fā)的NO-合成酶表達之減低)會抵消形成所提及的心血管并發(fā)癥的基礎之炎癥過程與隨后的纖維增生性血管壁重建。
要在血管成形術之后以藥物方式驗證再狹窄的所有先前嘗試都不能在大部分患者體內(nèi)達到合意的效應。目前，有兩種局部治療原理是較有利者已經(jīng)認可過的血管內(nèi)近距放射線治療法(vascular brachytherapy)，即通過對擴張血管段施以短時間放射照射以檢查細胞生長之方法，以及仍然處于臨床試驗中的藥物洗脫支架(drug-eluting stent)。此方法包括用“飽含(impregnated)”生長抑制性藥物(細胞生長抑制劑和免疫抑制劑)的聚合物涂覆支架，并于數(shù)周期間將該等藥物慢慢地釋放出。大部分最近的臨床研究證明雖然有令人鼓舞的初始結果，但是這兩種治療做法都不能免于某些程度的嚴重問題(例如引發(fā)梗塞危險的支架內(nèi)血栓形成(in-stent-thrombosis))。
除了已經(jīng)描述過的I型免疫不相容性反應之外，原則上還有四種在免疫調(diào)節(jié)上分別為變應性和障礙的其他形式。I型反應本身在致敏化(allergisation)完成之后主要可分為兩個階段血管活性炎性介質從結合了IgE的肥大細胞快速釋放出和再生，以及由被吸引的嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞所介導的晚期反應。完整的I型反應可能依據(jù)對過敏原的暴露而局部性或系統(tǒng)性發(fā)生。呼吸空氣中的過敏原會誘發(fā)呼吸道中的反應，典型地會并發(fā)粘膜水腫和過度分泌(變應性鼻病，枯草熱)以及支氣管痙攣(哮喘)，而營養(yǎng)物中的過敏原則誘發(fā)胃腸道癥狀如惡心、嘔吐和腹瀉。皮膚對過敏原的反應為發(fā)癢與蕁麻疹以及異位性皮炎(atopicdermatitis)(神經(jīng)性皮炎)。不過，假使過敏原直接進入到血流之內(nèi)(例如血液制品的注入，藥物)或假若對過敏原的暴露特別地強，會導致全身立即出現(xiàn)反應，可能招致威脅生命的血壓降低(過敏性休克)。
于II型反應的情況中，是由具有抗原活性的細胞(例如外來的血細胞)或細胞外蛋白質(例如在體內(nèi)天然存在的細胞表面上被藥物誘導的變化)起中心作用。于致敏化之后，再次接觸導致IgG-和IgM-型過敏原特異性抗體的產(chǎn)生，這些可大量地結合到過敏原性細胞(調(diào)理作用(opsonisation))。由此將補體系統(tǒng)(膜作用性復合物之形成)和一特別的淋巴細胞亞群，天然殺手細胞(NK-細胞)等予以活化。其結果為過敏原性細胞通過細胞溶解作用(cytolysis)而破壞。當自身抗體作用到身體內(nèi)天然產(chǎn)生的結構例如腎血管球微血管的基底膜時，也會誘發(fā)類似的反應且由此誘發(fā)伴有急性腎功能不全之急進型腎小球腎炎。除了1型T-輔助細胞(Th1-細胞，參看下文)之外，經(jīng)活化的NK-細胞為干擾素-γ的主要產(chǎn)生者，干擾素-γ為一種細胞因子，可大幅地強化炎癥反應，特別是通過將巨噬細胞活化的炎癥反應。
III型反應的特征在于免疫復合物(抗原-抗體復合物)的形成和沉積，隨后活化補體系統(tǒng)與吞噬細胞(粒細胞，巨噬細胞)。這些細胞會在血液中循環(huán)且繼而主要沉積于腎血管球的微血管之內(nèi)，不過也會沉積在關節(jié)內(nèi)或皮膚內(nèi)。由此誘發(fā)出的炎癥反應可能帶來(免疫復合物性)腎小球腎炎，關節(jié)內(nèi)疼痛以及蕁麻疹。若免疫系統(tǒng)不能消除掉誘因劑(例如鏈球菌)之時，感染也可能誘發(fā)系統(tǒng)性III型反應。代表性局部III型反應為免疫接種之后皮膚內(nèi)的所謂Arthus反應或于抗原-抗體復合物在肺部中沉積的情況中發(fā)生的外源性過敏性肺胞炎(例如養(yǎng)鳥人肺(bird-breederlung))。系統(tǒng)性紅斑狼瘡也是一種III型反應不過因為有自身抗體之形成而歸屬于自身免疫性疾病。
與前面所提及的過敏性反應不同，IV型反應不是體液性而是細胞性且經(jīng)常要到數(shù)天之后才會達到其最高點(遲發(fā)型反應或遲發(fā)型過敏反應)。誘發(fā)劑主要為蛋白質、侵入的外來生物體(細菌、病毒、真菌和寄生體)，其他外來蛋白質(例如于乳糜瀉情況中的小麥衍生之麥膠蛋白(gliadin))以及半抗原(haptens)(藥物、金屬[例如接觸性皮膚炎情況中的鎳]，化妝品與植物成分)。移植器官的原發(fā)性排異也是一種IV型反應?？乖瓡?組織)巨噬細胞所吞噬、處理與呈遞給純真T-輔助細胞(CD4-陽性)；T-輔助細胞的致敏化需要花數(shù)天之久。以此種方式第二次接觸時T-輔助細胞會變更成為Th1-細胞；其中CD-154介導的抗原呈遞細胞(此細胞系表達CD40-受體)之共刺激扮有重要角色，因為此種信號途徑可觸發(fā)白介素-12從巨噬細胞被釋放出來。白介素-12可起始T-輔助細胞的分化與增生。Th1-細胞本身則通過某些生長因子(例如GM-CSF)而激發(fā)骨髓中的單核細胞形成，利用某些細胞因子(例如MIF)使之得到補充，并通過釋放IFNγ使之活化。如此所得非常強烈的炎癥反應可能大規(guī)模破壞身體內(nèi)正常的組織(例如結核病)或移植的組織。再者，CD8-陽性細胞毒性T-細胞參與了移植物排異(細胞溶解)，該CD8-陽性細胞毒性T-細胞能夠辨識其目標(外來細胞表面)，且相應地僅通過像CD4-陽性Th1細胞一般以事先的抗原呈遞將其“武裝”起來。
類似于IV型反應的免疫調(diào)節(jié)障礙可形成例如類風濕性關節(jié)炎或多發(fā)性硬化(自身反應性Th1-細胞)以及糖尿病(自身反應性細胞毒性T-細胞)的基礎。除了細菌超抗原(例如TBC誘因劑)和相應的遺傳傾向(例如MHC-蛋白，Th1/Th2平衡缺失)之外，經(jīng)針對一些誘因劑(例如鏈球菌)之特定抗原的、與自身抗原(在身體內(nèi)產(chǎn)生，分子模擬)交叉反應的T-細胞也可能對這些自身免疫疾病起著作用。不同的是，第V型反應可能通過，與其他一起者，活化或阻斷激素受體的自體抗體(例如于Basedow’s病中的促甲狀腺激素(thyrotropin))或神經(jīng)遞質受體(例如在重癥肌無力(myasthenia gravis)中的乙酰膽堿)而引發(fā)。
與移植物排異可相比—但相反義者—為移植物抗宿主病(graft versushost disease)(GVHD)，其出現(xiàn)于約40％受者的異體骨髓轉植(遺傳學上不相同的諸個體之間)的過程中。于持續(xù)長達三個月的急性期中，已經(jīng)與干細胞一同輸注的供體的T-細胞會攻擊宿主生物體。所造成的可能為嚴重的炎癥反應會優(yōu)先顯示在皮膚、胃腸道和肝臟。
為了治療有關的誘因引起的急性炎病，經(jīng)常是分別利用非甾體類消炎藥(NSAID，與其他一起，抑制前列腺素之合成)及/或抗感染藥物(殺滅細菌、真菌或寄生蟲)和抗病毒化療藥物，偶然也會采用臨時局部施用糖皮質激素(基因表達的通用抑制劑)。于嚴重或慢性復發(fā)性炎性疾病的情況中，可進行全身方式施用糖皮質激素或免疫抑制劑(抑制T-細胞活化)或細胞生長抑制劑例如氨甲喋呤(methotrexate)。此亦分別用于器官和骨髓的移植。雖然其具有無可置疑的治療效用，不過所提及的藥物的全身性施用仍然可能引發(fā)嚴重的副作用，尤其是在長期施用之時。例如，服用氨甲喋呤2或更多年的患者之中有多達25％會發(fā)展出嚴重的肝硬化。更近的特別是用于慢性復發(fā)性炎性疾病之活性藥物可阻斷TNFα的促炎癥效應(proinflammatory effect)分別針對細胞因子本身及其受體的抗體，受體的低分子量拮抗劑以及會捕捉細胞因子的經(jīng)重組產(chǎn)生的可溶性受體蛋白質。不過在使用受體蛋白質治療的過程中，有越來越多的跡象顯示感染性疾病(與其他一起者結核病)的發(fā)生率有增加，且有約40％的患者似乎對于治療根本沒有反應(無反應者)。此外，對于經(jīng)認可的人源化TNFα-抗體，在起始治療2-4年之后，也有關于會引起感染乃至發(fā)生敗血癥的相應的警告。再者，此兩種活性藥物在緊急事件中都是禁忌使用者。此外，經(jīng)認可者還有主要用于治療哮喘的、白三烯類受體的低分子量拮抗劑，以及環(huán)加氧酶-2(cyclooxygenase-2)的抑制劑，一種新穎的，具有比傳統(tǒng)NSAID顯著減低的胃腸副作用的非甾體類消炎藥(NSAID)。再者，有一系列其他——通常為經(jīng)人源化的——抗體或反義寡核苷酸為基礎的方法分別用以對抗白細胞與內(nèi)皮細胞的粘附分子、T-輔助細胞的細胞因子受體或IgE-抗體，這些正處于不同的臨床試驗階段之中。為了避免使用糖皮質激素和抗感染劑一類的藥物，必須一致地將所提及的藥物特異地導向于與治療有相關性的目標分子。
綜上所述，本發(fā)明以下述問題為基礎針對受患病人的罹病率和死亡率提供物質用以預防或治療過度的炎癥反應及與此伴隨的并發(fā)癥。
該問題系由本專利權利要求書所界定的主題予以解決。


本發(fā)明要用下面諸圖式予以更詳細地說明。
圖1顯示出在經(jīng)培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞中利用相應的順式作用元件誘餌(cis-element-decoy)(SEQ ID NO33)中和轉錄因子STAT-1以抑制經(jīng)細胞因子刺激的CD40(a、b、d和e)、E-選擇蛋白和MCP-1之表達(a)以及經(jīng)CD40配體誘導的白介素-12p40表達。(a)在經(jīng)與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)或NF-κB順式作用元件誘餌(10μM)預孵育4小時且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育9小時的內(nèi)皮細胞內(nèi)進行的E-選擇蛋白、MCP-1和CD40 mRNA-表達之代表性RT-PCR-分析(此外將光密度計分析(“強度”)表為經(jīng)刺激的對照樣品之％且相對于內(nèi)標準樣品rp132進行參比)。(b)在經(jīng)與STAT-1順式作用元件誘餌(10μM；SEQ ID NO33)預孵育4小時且隨后與約670000個P3xTB.A7-細胞/毫升(這些小鼠骨髓瘤細胞會穩(wěn)定地表達人類CD40-配體CD154)和1000U/毫升干擾素-γ孵育12小時的內(nèi)皮細胞內(nèi)進行的白介素-12p40 mRNA-表達之代表性RT-PCR-分析(此外將光密度計分析(“強度”)表為經(jīng)刺激的對照樣品之％且相對于內(nèi)標準樣品rp132進行參比)。(c)在經(jīng)與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)或相應的對照寡核苷酸(STAT-1-25mut)預孵育4小時(濃度10μM)且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育12小時的內(nèi)皮細胞內(nèi)進行的CD40 mRNA-表達之代表性RT-PCR-分析(此外將光密度計分析(“強度”)表為經(jīng)刺激的對照樣品之％且相對于內(nèi)標準樣品EF-1進行參比)。(d)對于STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)對在經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中所進行的經(jīng)細胞因子刺激的CD40 mRNA-表達的影響所做的5個獨立實驗之統(tǒng)計學分析小結(*p＜0.05相對于經(jīng)刺激的對照細胞)。(e)對于STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)對在經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中所進行的經(jīng)細胞因子刺激的CD40蛋白質-表達24小時之后的影響之代表性Western印跡分析與光密度分析(“強度”表示為經(jīng)刺激的對照樣品之％且相對于內(nèi)標準樣品β-肌動蛋白(β-actin)進行參比)。于其他實驗中也得到可相比較之結果。
圖2顯示出在經(jīng)培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞中通過基于反義寡核苷酸的轉錄因子STAT-1的表達的下調(diào)抑制經(jīng)細胞因子刺激的CD40基因表達。(a)CD40-蛋白質和STAT-1-蛋白質分別在靜止條件下以及在將細胞與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育14小時之后的表達。圖中左格顯示出使用不同批次細胞進行的2-4次實驗之統(tǒng)計學分析小結，圖中右格顯示出代表性Western印跡分析與光密度分析(“強度”表示為未經(jīng)刺激的對照樣品之％且相對于內(nèi)標準樣品β-肌動蛋白(β-actin)進行參比)(*p＜0.05相對于未經(jīng)刺激的對照細胞)。(b)在使用STAT-1-反義寡核苷酸(1μM；SEQ ID NO33)預處理24小時的經(jīng)刺激的內(nèi)皮細胞中，CD40-蛋白質和STAT-1-蛋白質的表達之可相比較的抑制。2次實驗的結果的小結(圖中左格；*p＜0.05相對于經(jīng)刺激的對照細胞)與代表性Western印跡分析(圖中右格)。
圖3顯示出轉錄因子IRF-1在單核細胞系THP-1中的表達(a)以及NO-合成酶的誘導型異構體(inducible isoform)在經(jīng)培養(yǎng)的人類平滑肌細胞中的表達利用相應的順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)中和轉錄因子STAT-1之抑制作用。(a)代表性Western印跡分析與光密度分析(“強度”表示為經(jīng)刺激的對照樣品之％且相對于內(nèi)標準樣品β-肌動蛋白。經(jīng)培養(yǎng)的THP-1-細胞系與順式作用元件誘餌(10μM)預孵育4小時且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育3小時。(b)圖中左格使用與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)、NF-κB順式作用元件誘餌或GATA-2順式作用元件誘餌(10μM)預孵育4小時且隨后與1000U/毫升干擾素-γ，60U/毫升白介素-1β，100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1微克/毫升細菌脂多糖孵育9小時的不同批次經(jīng)培養(yǎng)的人類平滑肌細胞所進行的3個實驗之統(tǒng)計學分析小結。NO-合成酶的誘導型異構體mRNA-表達之RT-PCR-分析(*p＜0.05相對于經(jīng)刺激的細胞＝100％)。圖中右格使用不同批次細胞進行的3個實驗之統(tǒng)計學分析小結及通過分別與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)和NF-κB順式作用元件誘餌預孵育以對NO-合成酶蛋白質的經(jīng)細胞因子刺激的表達(暴露20小時之后)產(chǎn)生抑制之代表性Western印跡分析(*p＜0.05相對于經(jīng)刺激的細胞＝100％)。
圖4顯示出使用不同的順式作用元件誘餌(SEQ ID NO17、25、29、31、33、35、37、39和突變的對照寡核苷酸STAT-1-19mut和STAT-1-25mut)對單核細胞系THP1的細胞核提取物中所含內(nèi)源性STAT-1的中和。代表性EMSA分析。經(jīng)培養(yǎng)的THP-1細胞系與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育3小時且隨后即用來制備細胞核提取物。將細胞核提取物分別與[32P]-標記的雙鏈SIE-寡核苷酸(Santa Cruz Biotochnologie，Heidelberg，Germany)及相應的順式作用元件誘餌和對照寡核苷酸在室溫下共孵育20分鐘且隨后施以電泳移動偏移分析。
圖5顯示出所選出的STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO17、31、35、37)對于E-選擇蛋白和MCP-1mRNA在得自胸腺靜脈的人類平滑肌細胞中的表達之影響。培養(yǎng)細胞(第2道)與相應的順式作用元件誘餌(10μM)預孵育4小時且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育9小時。代表性RT-PCR-分析，于其他實驗中得到可相比較的結果。
圖6以基因圖譜示意地顯示出STAT-1-反義表達載體pCI/Stat1 AS的結構。
圖7顯示出使用不同的順式作用元件誘餌(SEQ ID NO17、19、27、33和39)對于經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中所含STAT-1進行中和的結果。代表性EMSA-分析，與光密度分析(“強度”)。經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞系與誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)孵育4小時且隨后用100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ刺激30分鐘。對于EMSA-分析，使用經(jīng)刺激的細胞的細胞核提取物和[32P]-標記的雙鏈SIE-寡核苷酸(Santa CruzBiotochnologie，Heidelberg，Germany)。
圖8顯示出STAT-1順式作用元件誘餌(STAT-1cons，10nmol，SEQ ID NO19)而非突變的對照寡核苷酸(STAT-1mut，10nmol，SEQ IDNO61)對于在雄豚鼠體內(nèi)經(jīng)DNCB-誘導的接觸性皮膚炎的影響的組織學分析(原始x400，總共17只受檢豚鼠的典型結果)。
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出參與在人類內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中以及在單核細胞中細胞因子介導的促炎性基因產(chǎn)物(CD40、E-選擇蛋白、NO-合成酶的誘導型異構體、白介素-12[p40]、MCP-1)表達的增加中的轉錄因子。由此可以證明，在經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞中使用TNFα和CD154分別與IFNγ組合進行刺激的情況中，于轉錄因子核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)與轉錄信號轉導子與活化子-1(signal transducer and activator oftranscription-1，STAT-1)之間存在著協(xié)同作用(synergism)。相同的情形也分別發(fā)生于經(jīng)培養(yǎng)的平滑肌細胞和單核細胞。
IFNγ單獨地能夠增加CD40在人類內(nèi)皮細胞內(nèi)的表達，而E-選擇蛋白或白介素-12則不能。對于很難且非組成型地在內(nèi)皮細胞內(nèi)分別表達的此兩種基因產(chǎn)物之表達，有必要分別與TNFα(E-選擇蛋白)和CD154(白介素-12)同時刺激細胞。再者，另一轉錄因子，干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)的重新(de novo)表達為IFNγ-介導的CD40而不是E-選擇蛋白在內(nèi)皮細胞和單核細胞內(nèi)的表達之增加所必需。于這些分析的范圍之內(nèi)，可以證明IRF-1-蛋白質表達在使用IFNγ且特別是使用TNFα單獨刺激細胞的情況中比在兩種細胞因子都存在的情況中顯著地較為弱。根據(jù)此點，轉錄因子NF-κB和STAT-1在IRF-1基因的轉錄情況中也會協(xié)同地作用(Ohmore等，J.Biol.Chem.，(1977)，272，14899)。
STAT-1(分別為GenBank Accession Number NM007315和XM010893及http://transfac.gbf.de/cgi-bin/qt/getEntry.pl？t0149)系屬于一組包括至少6種成員的轉錄因子。STAT-1基因產(chǎn)物系由大部分細胞所組成型地表達，不過通常系以非活性單體型蛋白質之形式(91kDa)存在于細胞質之內(nèi)。此種p91-亞單位(subunit)的酪氨酸-磷酸化與后續(xù)的兩個這種p91-亞單位(稱為STAT-1α)的結合(二聚體化)可促成從此時起成為活性的轉錄因子運載到細胞核之內(nèi)。也可以進行與STAT-1β所含p84-亞單位(相同基因的不同剪切產(chǎn)物)的異二聚體化(hetero-dimerisation)。以組成方式存在的亞單位之磷酸化是通過細胞質janus激酶(janus-kinases)依賴刺激而發(fā)生的。所以，兩種janus激酶(Jak1和Jak2)都會受IFNα所刺激(更好地回復到干擾素受體)；與此相反，就(病理)生理學而言，作為STAT-1活化的最重要的刺激，IFNγ，則只刺激Jak2。不同的生長因子和肽類激素(例如血管緊張素II)也會活化STAT-1；除了固有的(生長因子)受體酪氨酸激酶之外，還有一種有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAP-激酶)也對此具有作用。與STAT-1α不同， STAT-1β不具有反式激活活性(transactivating activity)，亦即基因表達刺激活性。
STAT-1參與在白細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中的一系列潛在促炎性基因產(chǎn)物的表達之中，其中轉錄因子的活化經(jīng)常以IFNγ-依賴性方式發(fā)生。一項例外為，白介素-6在血管緊張素II-刺激血管平滑肌細胞內(nèi)的STAT-1-依賴性表達(Schieffer等，Circ.Res.(2000)，87，1195)。蛋白質，也包括STAT-1，可經(jīng)使用非常不同的方式來抑制其活性。如此，可以使用，例如，抗STAT-1抗體以及天然或合成的物質來減低STAT-1與DNA的相互作用，亦即，降低轉錄活性。再者，也可以抑制導致STAT-1活化的信號途徑(Jak1、Jak2、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine-kinases)、MAP-激酶)。要將STAT-1的活性特異性地抑制所用的優(yōu)選的方法為1.使用誘餌寡核苷酸中和(抑制(squelching))活化的轉錄因子，2.利用反義寡核苷酸抑制STAT-1-蛋白質表達，與3.利用反義表達載體抑制STAT-1-蛋白質表達。
本文中所使用的術語“誘餌寡核苷酸”或“順式作用元件誘餌”分別指稱雙鏈DNA分子和雙鏈DNA寡核苷酸。兩條DNA鏈均具有一互補序列。于本發(fā)明中，順式作用元件誘餌具有的序列與基因組內(nèi)的天然STAT-1核心結合序列一致或類似，且其可被細胞內(nèi)部的轉錄因子STAT-1所結合。如此，順式作用元件誘餌可作為STAT-1競爭抑制(優(yōu)選的為中和作用)中所用的分子。
本發(fā)明的一方面提供了能夠以序列特異性方式結合轉錄因子STAT-1的雙鏈DNA寡核核苷酸，該雙鏈DNA寡核核苷酸具有下列序列之一，雖然此處只示出每一種此類雙鏈DNA寡核核苷酸所含的一條鏈，不過其互補鏈也包括在本發(fā)明之內(nèi)5′-NTTNCBGDAAN-3′(SEQ ID NO1)，5′-ATTACCGGAAG-3′(SEQ ID NO3)，5′-ATTCCGGTAAG-3′(SEQ ID NO5)，5′-ATTCCTGGAAG-3′(SEQ ID NO7)，5′-ATTCCTGTAAG-3′(SEQ ID NO9)，5′-GTTCCAGGAAC-3′(SEQ ID NO11)，5′-GTTCCCGGAAG-3′(SEQ ID NO13)，5′-GTTCCGGGAAC-3′(SEQ ID NO15)，5′-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3′(SEQ ID NO17)，5′-TGTGAATTACCGGAAGTG-3′(SEQ ID NO19)，5′-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3′(SEQ ID NO21)，
5′-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3′(SEQ ID NO23)，5′-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3′(SEQ ID NO25)，5′-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3′(SEQ ID NO27)，5′-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3′(SEQ ID NO29)，5′-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3′(SEQ ID NO31)，5′-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO33)，5′-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3′(SEQ ID NO35)，5′-TGCATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO37)，5′-ATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO39)。
若在人類內(nèi)皮細胞內(nèi)使用根據(jù)本發(fā)明針對STAT-1的誘餌寡核苷酸而不是個別對照寡核苷酸，則細胞因子誘導的CD40表達(包括用IFNγ進行單一刺激及與IFNγ和TNFα組合刺激兩種情況)會被顯著地抑制超過50％。假若細胞的刺激是用IFNγ與TNFα和CD154分別進行，此種情況也分別發(fā)生于E-選擇蛋白及MCP-1和白介素-12(p40)的表達之中。根據(jù)此點，將STAT-1活性消除掉會帶來一組促炎性基因產(chǎn)物在人類內(nèi)皮細胞內(nèi)的表達之高度明顯的抑制。如此即可在此種治療措施的情況中于炎性疾病范圍之內(nèi)構思出使內(nèi)皮-白細胞相互作用(E-選擇蛋白，MCP-1)的明顯減低，而且也可使抗原呈遞細胞(例如巨噬細胞和B-淋巴細胞)與T-淋巴細胞(CD40、白介素-12)的相互作用明顯減低。類似地，此種情形也發(fā)生于已經(jīng)證明的在THP-1單核細胞內(nèi)的細胞因子誘發(fā)的IRF-1表達的減低(且由此將IRF-1依賴性基因的表達下調(diào))之中，以及細胞因子誘導的包括誘導型NO-合成酶在內(nèi)的所述基因產(chǎn)物在人類平滑肌細胞中的表達減低之中。
因此，STAT-1活性的特異性抑制所用的一種優(yōu)選的方法為使用根據(jù)本發(fā)明的含有STAT-1的結合位點的雙鏈DNA寡核核苷酸，也稱為順式作用元件誘餌或誘餌寡核苷酸。從外部給細胞提供大量的轉錄因子結合位點，特別是遠大于基因組內(nèi)所含數(shù)目的轉錄因子結合位點會產(chǎn)生一種狀況，其中有大部分的某一種轉錄因子會特異地結合到相應的順式作用元件誘餌而不會結合到其內(nèi)源性靶結合位點。對轉錄因子與其內(nèi)源性結合位點的結合予以抑制所用的這些方法也稱為抑制(squelching)。使用順式作用元件誘餌對轉錄因子的抑制(也叫做中和)可以成功地用來抑制細胞的生長。于此使用了含有對轉錄因子E2F的特異性轉錄因子結合位點之DNA片段(Morishita等，PNAS(1995)92，5855)。
防止轉錄因子STAT-1結合所用的核酸序列為例如在細胞內(nèi)部可與STAT-1自然結合之序列。STAT-1可特異地結合到具有下述序列的基序(motive)5’NNNSANTTCCGGGAANTGNSN-3’，其中的符號為N＝A、T、C或G且S＝C或G。具有下劃線的堿基的嚴格共有序列(consensus)以及這些堿基間的距離對于STAT-1的有效結合都是極為重要的。所以，根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌可能具有下述11體(11-mer)共有核心結合序列5’-NTTNCBGDAAN-3’(SEQ ID NO1)，其中的符號為B＝C、G或T，D＝A、G或T且N＝A、T、C或G。再者，該順式作用元件誘餌可以大于該11體核心結合序列，且可在5’-端及/或3’-端延長。在該核心結合序列區(qū)內(nèi)的相應突變會導致STAT-1對誘餌寡核苷酸之結合的妨害。
由于該順式作用元件誘餌為一種雙鏈核酸，因此根據(jù)本發(fā)明的DNA寡核核苷酸不僅包括有義或正向序列，而且也包括互補的反義或反向序列。本發(fā)明的優(yōu)選的DNA寡核苷酸具有如涵蓋在SEQ ID NO3至SEQ ID NO16之內(nèi)的STAT-1的11體核心結合序列。
不過該順式作用元件誘餌也可以具有不同于前述序列且比11體更長的序列。特別優(yōu)選的為諸如涵蓋在SEQ ID NO17至SEQ ID NO40之內(nèi)的序列。這些順式作用元件誘餌含有2個分別針對STAT-1的結合位點。
“2個結合位點”于此涉及有義鏈和反義鏈。此優(yōu)選的序列名單不具限制性。對于本領域人員是顯而易知的，有眾多序列可以用為STAT-1的抑制劑，只要其具有先前提及的11體共有核心結合序列與對STAT-1的親和力之條件即可。
核酸序列對STAT-1的結合親和力可通過使用電泳遷移率變動分析(EMSA)予以評定(Sambrook等(1989)，Molecular Cloning.Cold SpringHarbor Laboratory Press；Krezesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191)。此種檢驗系統(tǒng)適合用于預期用在本發(fā)明方法中的核酸的質量控制，或用來測定結合位點的最佳長度。其亦適合用來鑒定會被STAT-1結合之其他序列。對于EMSA，打算用來分離新的結合位點時，最適當者為經(jīng)純化或經(jīng)重組表達的STAT-1形式，其可以用于數(shù)個更迭回合的PCR-擴增(PCR-amplification)并以EMSA進行選擇(Thiesen and Bach(1990)，Nucleic Acids Res.18，3203)。
已知在啟動子(promoter)區(qū)或增強子(enhancer)區(qū)含有STAT-1結合位點之基因中，或STAT-1對其表達具重要性的功能跡象且因而成為以本發(fā)明方法予以特異性抑制的可能的靶基因中，除了CD40-基因、E-選擇蛋白基因、可誘導型NO-合成酶基因、白介素-12(p40)-基因、和MCP-1-基因之外，還有其他促炎性基因，例如IFNγ本身，細胞因子白介素-6，粘附分子ICAM-1，PECAM-1(血小板內(nèi)皮細胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1))，RANTES(活化調(diào)節(jié)，正常T-細胞表達，可能分泌(regulated upon activation，normal T-cellexpressed，presumed scrected)；由T-淋巴細胞可溶性分泌)和VCAM-1，趨化因子白介素-8、IP-10(干擾素-誘導型蛋白質-10)與Mig(γ-干擾素誘導出的單核因子(monokine))以及MHC-蛋白質I和II。于此，不論這些基因的表達是否由STAT-1直接地或間接地調(diào)節(jié)都沒有關系(例如通過IRF-1的STAT-1-依賴性表達)。
本發(fā)明方法可調(diào)控一基因或多基因的轉錄，其方式為使得該基因或該多基因，例如E-選擇蛋白，不表達或較低地表達。在本發(fā)明范圍之內(nèi)，經(jīng)減低或經(jīng)抑制的表達意指相對于沒有使用根據(jù)本發(fā)明的雙鏈DNA寡核核苷酸處理過的細胞比較之下轉錄速率較為減低。此種減低可以使用，例如Northern-blot印跡分析(Sambrook等，1989)或RT-PCR(Sambrook等，1989)予以測定。通常這些減低至少為2倍，特別者至少為5倍，更特別者至少10倍的減低?；罨膯适Э赡芡ㄟ^例如若STAT-1以轉錄激活子形式作用于某一基因且因此激活子的抑制導致該靶基因的表達的缺失而達到。
此外，本發(fā)明方法有助于基因表達的抑制之解除，條件是將該表達的阻斷的原因是通過一具有組成型活性或(在重復細胞刺激之后)用一活化的轉錄因子。對此的一個例子為，前內(nèi)皮素原-1基因(prepro-endothelin-1-gene)在兔頸靜脈(V.jugularis)天然內(nèi)皮細胞內(nèi)的表達之抑制，可以通過以針對轉錄因子CCAAT/增強子結合性蛋白質的順式作用元件誘餌予以解除(Lauth等，J.Mol.Med.(2000)，78，441)。對此，意指基因表達的抑制可經(jīng)解除使其產(chǎn)物發(fā)揮出保護性效用，例如對抗炎性疾病。如此，例如NO-合成酶的內(nèi)皮細胞的異構體，其產(chǎn)物NO對于內(nèi)皮細胞內(nèi)的促炎性粘附分子和細胞因子的表達之抑制起著關鍵性作用，可用IFNγ予以下調(diào)(Rosenkranz-Weiss等(1994)，J.Clin.Invest.93，1875)。對抗STAT-1的順式作用元件誘餌可通過抑制STAT-1對內(nèi)皮NO-合成酶基因所含啟動子中的相應結合位點之結合而逆轉此非合意的效應。
寡核苷酸通常會被核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶所快速降解，尤其是被DNase和RNase在細胞內(nèi)所降解。所以，DNA寡核核苷酸可經(jīng)修飾以穩(wěn)定化而對抗降解，由此在細胞內(nèi)可以長時期地維持住一高濃度的寡核苷酸。通常此種穩(wěn)定化可通過導入一或多種經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵而得到。
經(jīng)成功地穩(wěn)定化的DNA寡核核苷酸不一定在每一核苷酸間連鍵都含有一修飾。優(yōu)選的是將在順式作用元件誘餌的兩寡核苷酸之相應末端的核苷酸間連鍵予以修飾。其中可以將最后的六、五、四、三、二個或最后一個或在最后六個核苷酸間連鍵中的一或多個核苷酸間連鍵予以修飾。另外，在核酸中可以插入經(jīng)不同修飾的核苷酸間連鍵且由此產(chǎn)生的雙鏈DNA寡核核苷酸可通過使用常規(guī)EMSA-檢驗系統(tǒng)分析與STAT-1的序列特異性結合。此檢驗系統(tǒng)可以用來測定順式作用元件誘餌的結合常數(shù)及因而測定其親和力是否因該修飾而改變?？梢赃x擇仍然顯示出充足的結合作用之經(jīng)修飾順式作用元件誘餌，其中充分的結合意指為未修飾核酸的結合之至少約50％或至少約75％，且特別優(yōu)選的為約100％。
仍然顯示出充足的結合作用之具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的順式作用元件誘餌可以測試其在細胞內(nèi)是否比未修飾順式作用元件誘餌較為穩(wěn)定。對使用根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌“轉染”的細胞測試在不同的時間點仍然可利用的順式作用元件誘餌的量。其中，優(yōu)選的為使用經(jīng)熒光染料(例如得克薩斯紅(Texas-red))標記的順式作用元件誘餌或經(jīng)放射性(例如32P)標記的順式作用元件誘餌，隨后分別施以數(shù)字熒光顯微術和放射自顯術或閃爍掃描法(scintigraphy)。經(jīng)成功修飾的順式作用元件誘餌在細胞內(nèi)具有比未經(jīng)修飾的順式作用元件誘餌更為長的半壽期，優(yōu)選的至少約48小時，更優(yōu)選的至少約4天，且最優(yōu)選的至少約7天。
適當?shù)男揎椇塑账衢g連鍵經(jīng)摘列于Uhlmann和Peyman((1990)Chem.Rev.90，544)之中。可以用于本發(fā)明的方法之中的在核酸內(nèi)的經(jīng)修飾的核苷酸間磷酸殘基及/或非磷橋聯(lián)(non phosphorus-bridge)包括例如甲基膦酸酯(methylphosphonate)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯，而非磷核苷酸間類似物包括例如硅氧烷橋聯(lián)、碳酸酯橋聯(lián)、羧甲基酯橋聯(lián)(carboxymethylester-bridges)、乙酰胺酸酯橋聯(lián)(acetamidate-bridges)、及/或硫醚橋聯(lián)。在使用經(jīng)硫代磷酸酯修飾的核苷酸間連鍵的情況中，其優(yōu)選的不要位于胞嘧啶堿基與鳥嘌呤堿基間，因為若是如此，其可能導致順式作用元件誘餌的靶細胞的活化。
本發(fā)明另一具體實施方式
為通過在核酸中插入結構特定性所得核酸之穩(wěn)定化，此舉可以增長該核酸的半壽期。含有發(fā)夾型和鐘型DNA的這些結構經(jīng)揭示于US5,683,985之中。同時，可以將經(jīng)修飾的核苷酸間-磷酸-殘基及/或非磷-橋聯(lián)與所述的結構一起導入。接著可以對如是所得的核酸在上文所述檢驗系統(tǒng)中測試結合作用與穩(wěn)定性。
核心結合序列不僅可以存在于順式作用元件誘餌之中而且可以存在于載體(vector)之中。在一個優(yōu)選的具體實施方式
之中，該載體為一質粒載體(plasmid vector)且特別是一種能夠自體復制以增加所導入的雙鏈核酸所具穩(wěn)定性之質粒載體。
本發(fā)明的順式作用元件誘餌可以迅速地被攝取到細胞之內(nèi)。足夠的攝取之特征在于一或多種會受STAT-1所控制的基因的表達之調(diào)控現(xiàn)象。本發(fā)明的順式作用元件誘餌優(yōu)選的為在與細胞接觸約4小時之后，更佳者在約2小時之后，在約1小時之后，約30分鐘之后且最佳者在約10分鐘之后調(diào)控一基因或多基因的轉錄。在這些實驗中使用的典型混合物含有10微摩爾/升的該順式作用元件誘餌。
另外，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌在藥物制造中的用途。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌在一藥物的制造中之用途，該藥物用以預防或治療心血管并發(fā)癥(例如，在經(jīng)皮血管成形術之后的再狹窄，靜脈搭橋術的狹窄)，移植物排異，移植物抗宿主病(graft versus host disease)(GVHD)，在外科介入范疇中的缺血/再注入相關性損傷，免疫過敏性反應(I型至第V型)，自身免疫性疾病(例如，糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎)以及所有形式的急性、亞急性和慢性炎性疾病，特別是累及關節(jié)處者(例如，關節(jié)炎)，累及呼吸器官者(例如，支氣管哮喘(bronchial asthma)、慢性支氣管炎)，累及皮膚者(例如，牛皮癬(psoriasis)、神經(jīng)性皮炎(neurodermitis))以及累及胃腸道者(例如，潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、克隆氏病(Chron’sdisease))，包括感染性休克(septic shock)。
此外，本發(fā)明也涉及一種在細胞內(nèi)，特別是在內(nèi)皮細胞、表皮細胞、白細胞、平滑肌細胞、角質細胞或纖維母細胞之內(nèi)調(diào)控至少一種基因的轉錄的方法，包括下述步驟將所述的細胞與一混合物接觸，該混合物含有一或多種能夠以序列特異性方式結合到轉錄因子STAT-1的一或多種根據(jù)本發(fā)明的雙鏈核酸。一優(yōu)選的方法為，例如，對含有T-淋巴細胞的骨髓捐贈者在將其導入受者身體內(nèi)之前給予離體處理(ex vivotreatment)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌也可以置于一組合物中給患者施用或用于根據(jù)本發(fā)明的方法之中。含有根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌之組合物(于后文中稱為混合物)即可與靶細胞(例如，內(nèi)皮細胞、表皮細胞、白細胞、平滑肌細胞、角質細胞或纖維母細胞)接觸。此接觸的目的為將結合STAT-1的順式作用元件誘餌轉移到該靶細胞(亦即，以STAT-1依賴性方式表達出促炎性基因產(chǎn)物之細胞)之內(nèi)。所以，已知可以改善膜的穿透之核酸修飾及/或添加劑或輔助物質都可以用于本發(fā)明的范圍之內(nèi)(Uhlmann and Peyman(1990)，Chem.Rev.90，544)。
于一優(yōu)選的具體實施方式
中，根據(jù)本發(fā)明的混合物只含有核酸和緩沖液。適當?shù)捻樖阶饔迷T餌之濃度在至少0.1至100μM的范圍之內(nèi)，優(yōu)選的者10μM，于其中加入一或多種適當?shù)木彌_液。這些緩沖液的一個例子為林格溶液(Ringer’s solution)，其中含有145毫摩爾/升的Na+、5毫摩爾/升的K+、156毫摩爾/升的Cl-、2毫摩爾/升的Ca2+、1毫摩爾/升的Mg2+、10毫摩爾/升的HEPES、10毫摩爾/升的D-葡萄糖、pH 7.4。
于本發(fā)明另一具體實施方式
中，該混合物另外含有至少一種添加劑及/或輔助物質。諸如脂質、陽離子脂質、聚合物、脂質體、納米粒子、核酸-適合體(nucleic acid-aptameres)、結合了DNA的肽和蛋白質等或合成的肽-DNA-分子等之添加劑及/或輔助物質都為預期使用者，以期(i)增加，例如，核酸導入到細胞之內(nèi)，以期(ii)僅將混合物導向一細胞亞群，以期(iii)在細胞內(nèi)抑制核酸的降解，以期(iv)在其使用之前幫助核酸混合物的貯存。肽類和蛋白質或合成的肽-DNA-分子的例子有例如抗體、抗體片段、配體、粘附分子等，其全部都可經(jīng)修飾或可以不經(jīng)修飾。
可以將順式作用元件誘餌穩(wěn)定化在細胞內(nèi)部的添加劑為例如核酸-濃縮物質(nucleic acid-condensing substance)諸如陽離子聚合物、聚-L-賴氨酸或聚乙亞胺。
本發(fā)明方法中所使用的混合物優(yōu)選的是通過注射、插管、栓劑、氣霧劑(分別經(jīng)鼻和經(jīng)口噴入，吸入)、套管針、投射(projectile)、Pluronic凝膠、可將藥物持續(xù)釋放的聚合物、或有助于局部進入的任何其他裝置等進行局部施用。將本發(fā)明方法中所使用的混合物進行離體使用(ex vivouse)也可以促成局部進入。
不過，STAT-1活性的抑制可以不僅是在前述方法中于蛋白質層次上予以抑制，而且可以在轉錄因子蛋白質的轉譯之前或之中就予以完成。該抑制可以用所謂的反義寡核苷酸予以實施。反義寡核苷酸可以在三個不同的層次上抑制靶基因的合成，亦即，在轉錄之過程中(防止hnRNA-合成)，于hnRNA的處理(剪切)導致mRNA之過程中及在在核糖體上面mRNA轉譯成蛋白質之過程中。利用反義寡核苷酸來抑制基因表達所用的方法系一種現(xiàn)有技術且為本領域人員所熟知。本發(fā)明另一方面為可特異地抑制STAT-1表達且具有下列序列中之一的反義寡核苷酸5′-TACCACTGAGACATCCTGCCAC-3′(SEQ ID NO41)，5′-AACATCATTGGCACGCAG-3′(SEQ ID NO42)，5′-GTGAACCTGCTCCAG-3′(SEQ ID NO43)。
該反義寡核苷酸可為單鏈DNA分子，RNA分子或為單鏈DNA-RNA雜合分子。該反義寡核苷酸更可具有一或多個經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵，例如前面對順式作用元件誘餌所述及者。在通過硫代磷酸-修飾核苷酸間連鍵予以穩(wěn)定化的反義寡核苷酸的情況中，特別要考慮到在胞嘧啶堿基與鳥嘌呤堿基間不要插入硫代磷酸-修飾核苷酸間連鍵，因為如此可能導致——特別是——具有免疫活性的細胞(例如內(nèi)皮細胞)的類似被IFNγ活化且因而會，至少部分地，阻礙產(chǎn)生合意的治療效果。
該反義寡核苷酸不僅可以用單鏈核酸分子之形式施用，而且可以用包含在一載體內(nèi)的形式施用。在一優(yōu)選的具體實施方式
中，該載體為一質粒載體且特別是一種能夠自體復制由此可增加所導入的單鏈核酸所具穩(wěn)定性的質粒載體。
本發(fā)明的另一方面因而為一種反義寡核苷酸載體，于轉染之后其本身要在靶細胞內(nèi)部表達且會特異地抑制STAT-1的表達。于此，可以考慮根據(jù)現(xiàn)有技術可得到的任何真核生物表達載體。優(yōu)選的考慮Promega公司的pCI-質粒(目錄編號No.E1731，GenBank Accession NumberU47119)，其中將包括STAT-1基因節(jié)段(segment)的2350bp(-121至+2229，GenBank Accession Number XM010893)以相反方向(3’→5’)克隆。此STAT-1基因節(jié)段的側翼接著兩個EcoRI限制位點且含有一個XhoI限制位點。其表達受到CMV-啟動子的控制。整個質粒(稱為pCI/Stat1 AS)包括6365bp。
以反義寡核苷酸為基礎的STAT-1蛋白質表達之調(diào)控也可以在人類內(nèi)皮細胞中抑制經(jīng)細胞因子誘導的CD40-表達，達到與用誘餌寡核苷酸者相同的程度。
此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的反義寡核苷酸在藥物制造中的用途。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸在一種藥物的制造中的用途，該藥物用以預防或治療心血管并發(fā)癥(例如，在經(jīng)皮血管成形術之后的再狹窄，靜脈搭橋術的狹窄)，移植物排異，移植物抗宿主病(graft versus host disease)(GVHD)，在外科介入范疇中的缺血/再注入相關性損傷，免疫過敏性反應(第I至V型)，自身免疫性疾病(例如，糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關節(jié)炎)以及所有形式的急性、亞急性和慢性炎性疾病，特別是累及關節(jié)處者(例如，關節(jié)炎)，累及呼吸器官者(例如，支氣管哮喘(bronchial asthma)、慢性支氣管炎)，累及皮膚者(例如，牛皮癬(psoriasis)、神經(jīng)性皮炎(neurodermitis))以及累及胃腸道者(例如，潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、克隆氏病(Chron’s disease))，包括感染性休克(septic shock)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸也可以置于一組合物中給患者施用。該組合物可包括穩(wěn)定化性添加劑或輔助物質以幫助，例如，將該反義寡核苷酸導入到細胞內(nèi)，將組合物僅導向到一細胞亞群，防止例如該反義寡核苷酸在細胞內(nèi)部的降解，或幫助例如在使用之前該反義寡核苷酸的貯存。
下面的圖式和實施例僅用來示范說明用而不是要用來以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
實施例1.細胞培養(yǎng)通過用1.6U/毫升的溶于HEPES-修飾Tyrode溶液的分散酶(dispase)在37℃下處理30分鐘而從臍帶靜脈分離出人類內(nèi)皮細胞，且置于經(jīng)明膠包被(2毫克/毫升明膠/0.1N HCl，在室溫下30分鐘)的6-孔組織培養(yǎng)皿上，于1.5毫升M199培養(yǎng)基(Gibco Life Technologies，Karlsruhe，Germany)中培養(yǎng)，其中含有20％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升鏈霉素，10U/毫升制霉菌素(nystatin)，5mM HEPES和5mMTES，1微克/毫升肝素和40微克/毫升內(nèi)皮生長因子。這些細胞以其典型的鋪路石型態(tài)，對yon Willebrandt-因子(vWF)的陽性免疫染色及用熒光計檢測(FACS)PECAM-1(CD31)，以及對平滑肌α-肌動蛋白(α-actin)的陰性免疫染色予以鑒定(Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191)。人類單核細胞系THP-1(ATCC TIB 202)以RPMI 1640培養(yǎng)基(LifeTechnologies)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升鏈霉素，和10U/毫升制霉菌素。人類平滑肌細胞從切下的胸腺靜脈利用外植體技術(the explant-technology)分離(Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191)，且置于經(jīng)明膠包被(參閱上文)的6-孔組織培養(yǎng)皿上，于1.5毫升Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含有15％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升鏈霉素，和10U/毫升制霉菌素。該細胞以對平滑肌α-肌動蛋白的陽性免疫染色予以鑒定。
2.RT-PCR分析內(nèi)皮細胞總RNA使用Qiagen RNeasy試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)分離，且接著進行DNA合成，其中根據(jù)制造商的實驗程序使用最大量3微克RNA和200U SuperscriptTMII逆轉錄酶(reversetranscriptase)(Life Technologies)，總體積為20微升。為了調(diào)整cDNA裝載率，于50微升總體積中使用5微升(約75毫微克cDNA)所得的cDNA溶液和延長因子-1(the elongation factor 1)(EF-1)的引物對(primerpair)(Gibco)，及1U Taq DNA聚合酶(Gibco)進行PCR。EF-1作為PCR的內(nèi)標準。在含有0.1％溴乙錠(ethidium bromide)的1.5％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物并使用一CCD攝影系統(tǒng)與Scanalytics的One-Dscan凝膠分析軟件(Billerica，MA，USA)，通過光密度法測定條帶的強度以調(diào)整隨后的PCR分析中的cDNA的體積。
所有PCR反應都是在Hybaid OmnE Thermocycler(AWG；Heidelberg，Germany)中針對每一引物對分別地實施。針對得自臍帶靜脈的人類內(nèi)皮細胞的cDNA，所用的特殊的PCR條件為CD40(產(chǎn)物大小381bp，25循環(huán)，退火溫度(annealing temperature)60℃，(正向引物)5’-CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3’(SEQ ID NO44)，(反向引物)5’-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3’(SEQ ID NO45))；E-選擇蛋白(產(chǎn)物大小304bp，33循環(huán)，退火溫度60℃，(正向引物)5’-AGCAAGGCATGATGTTAACC-3’(SEQ ID NO46)，(反向引物)5’-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3’(SEQ ID NO47))；EF-1(產(chǎn)物大小220bp，22循環(huán)，退火溫度55℃，(正向引物)5’-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO48)，(反向引物)5’-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO49))；IL-12p40(產(chǎn)物大小281bp，30循環(huán)，退火溫度62℃，(正向引物)5’-GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3’(SEQ ID NO50)，(反向引物)5’-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3’(SEQ ID NO51))；rpl32(產(chǎn)物大小368bp，20循環(huán)，退火溫度60℃，(正向引物)5’-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3’(SEQ ID NO52)，(反向引物)5’-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3’(SEQ ID NO53)；MCP-1(產(chǎn)物大小330bp，22循環(huán)，退火溫度63℃，(正向引物)5’-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3’(SEQ ID NO54)，(反向引物)5’-ACGAATTCTTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3’(SEQ IDNO55)。
3.電泳遷移率變動分析(EMSA)按照Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191中所述，進行細胞核提取物，并進行[32P]-標記的雙鏈共有寡核苷酸(Santa Cruz Biotechnologie，Heidelberg，Germany)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯術和超級遷移率變動試驗(supershift-analysis)。于此使用具有以下所示單鏈序列(核心結合序列以下劃線標出)的雙鏈DNA寡核核苷酸SIE，5’-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTC-3‘(SEQ ID NO56)。為分析使用各種順式作用元件誘餌對經(jīng)細胞因子刺激的THP-1細胞(前單核細胞人類細胞系(pre-monocytous human cell line)的細胞核提取物中所含內(nèi)源性STAT-1之擠出作用(extrusion)，在EMSA結合方法中選用30∶1(STAT-1順式作用元件誘餌[32P]-標記的SIE的寡聚核苷酸(11fmol))的比例。
4.誘餌寡核苷酸技術按照Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191中所述，使用互補的單鏈硫代磷酸連接的寡核苷酸(Eurogentec，Kln，Germany)產(chǎn)生雙鏈誘餌寡核苷酸。將培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細胞與濃度為10μM的相應的誘餌寡核苷酸預孵育4小時。此為事先根據(jù)EMSA和RT-PCR分析予以最優(yōu)化的條件。于此之后，通常將含有誘餌寡核苷酸的培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基予以更換。該寡核苷酸的單鏈序列如下(下劃線的字母代表經(jīng)硫代磷酸連接的堿基，序列都是按5’→3’之方向顯示)GATA-2，CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTCT(SEQ ID NO57)；NF-κB，AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC(SEQ ID NO58)；STAT-1，CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG(SEQ ID NO33)；STAT-1-19mut，GACAGTGCAGTGAACTGTC(SEQ ID NO59)；STAT-1-25mut，CATGTTATGCAGACCGTAGTAAGTG(SEQ IDNO60)。
5.反義寡核苷酸(ODN)技術對于反義方法，于100毫升OPTI-MEMI培養(yǎng)基中定加15微升脂質轉染試劑(Lipofectin)(Gibco Life Technologie，Karlsruhe，Germany)，且在室溫(RT)下孵育45分鐘(溶液A)。隨后在100微升OPTI-MEMI培養(yǎng)基中添加反義ODN(Eurogentec，Kln，Germany)到終濃度為0.5μM(溶液B)。在將溶液A和溶液B混合之后，于室溫下再度孵育15分鐘。于實驗起始之時，在裝有脂質轉染試劑-反義ODN復合物的Eppendorf管內(nèi)添加0.8毫升內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的常規(guī)細胞培養(yǎng)基(不含肝素和內(nèi)皮生長因子)，并將內(nèi)皮細胞培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基更換為反義-脂質轉染試劑培養(yǎng)基。于4小時之后取出反義-脂質轉染試劑培養(yǎng)基并用新鮮細胞培養(yǎng)基(含有肝素和內(nèi)皮生長因子)予以更換。STAT-1反義ODN的序列為5’-T*A*CCA*C*T*G*A*G*A*C*A*T*CC*T*GCC*A*C-3’(*硫代磷酸修飾的堿基；SEQ ID NO41)。
6.Western印跡分析將得自臍帶靜脈的人類內(nèi)皮細胞與得自胸腺靜脈的平滑肌細胞通過接續(xù)在液態(tài)氮中冷凍與在37℃(電熱組，Kleinfelden，Germany)下5分鐘的解凍予以碎裂。按照Hecker等(1994)，Biochem J.299，247中所述制備蛋白質提取物。采用標準實驗程序利用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳在變性條件下于SDS存在中分離出20-30微克蛋白質且予以轉移到BioTraceTM聚偏二氟乙烯轉移膜之上(polyvinylidene fluoride transfer membrane)(PallCorporation，Roβdorf，Germany)。使用下面的原抗體進行免疫蛋白質檢測CD40(多克隆，1∶2000稀釋，Research Diagnostics Inc.，F(xiàn)landersNJ，USA)，STAT-1蛋白質(單克隆，1∶5000稀釋，BD TransductionLaboratories，Heidelberg，Germany)，IRF-1蛋白質(多克隆，1∶2000稀釋，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany)，iNOS蛋白質(多克隆，1∶3000稀釋，BD Transduction Laboratories，Heidelberg，Germany)。于分別添加過氧化物酶綴合的抗-兔-IgG與——在使用單克隆抗體的情況中——添加相應的抗-小鼠-IgG(1∶3000，Sigma，Deisenhofen，Germany)之后，利用化學發(fā)光法(chemiluminescence method)(SuperSignal Chemiluminescent Substrate；Pierce Chemical，Rockford，IL，USA)和隨后的放射自顯影術(HyperfilmTMMP，Amersham Pharmacia，Biotech，Buckinghamshire，England)檢測蛋白質條帶。于“洗滌”轉移膜(5分鐘，0.2N NaOH，接著用H2O洗滌3×10分鐘)之后，通過用單克隆抗體和過氧化物酶綴合的抗-小鼠-IgG(兩者皆得自Sigma-Aldrich，1∶3000稀釋)檢測β-肌動蛋白的等量蛋白質條帶，而顯示出等量蛋白質的裝載率和轉移。
7.統(tǒng)計學分析若沒有給予不同的說明，附圖和文中的所有數(shù)據(jù)都表為n個實驗的平均值±SEM。采用Student’st-檢驗對未配對的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以p＜0.05視為具有統(tǒng)計學意義。
8.通過動物實驗檢測誘餌寡核苷酸的影響8.1小鼠為了檢測本申請所開發(fā)出的以誘餌寡核苷酸為基礎的治療法的功效，對每組8-10只動物的小鼠針對抗原誘發(fā)的關節(jié)炎進行“概念驗證研究(proof-of-concept-study)”(有關所用模型可參閱Henzgen等，Exp.Toxicol.Pathol.(1996)，48，255)。將單份0.25納摩爾的STAT-1-誘餌寡核苷酸(SEQ ID NO33)直接施加到關節(jié)(關節(jié)內(nèi)注射)，可以在3-14天期間內(nèi)高度明顯地減低關節(jié)的抗原誘發(fā)的腫脹(減低35％)、炎癥反應的強度(減低70％)、關節(jié)破壞(減低80％)、總關節(jié)炎評分(減低70％)、以及血清中的促炎性細胞因子的濃度(例如白介素-6，減低80％)。與此不同，相應的對照寡核苷酸都沒有治療功效。
此外，于此研究中值得注意的是，在關節(jié)炎誘發(fā)14天之后，于皮膚中引發(fā)的接觸性皮炎(IV型反應)——其由將抗原再度經(jīng)皮注射到動物體內(nèi)一次產(chǎn)生——也在經(jīng)誘餌寡核苷酸處理的小鼠體內(nèi)獲得高度明顯的抑制(減低35％)。
8.2豚鼠于7天中將豚鼠(Hartley，雄鼠，體重350克)致敏化兩次(于第一天在一側耳朵中，于第二天在另一側耳朵中，每次都使用50微升的10％DNCB(溶于50％丙酮/50％橄欖油的溶液)；于第七天，使用15微升的2％DNCB(溶于95％丙酮/5％橄欖油的溶液)在頸部皮膚中加強)之后，通過在第13天于動物刮過毛的背部一或多個大小約1平方厘米的部位上分別再施用2，4-二硝基氯苯(DNCB；10微升0.5％ DNCB，溶于95％丙酮/5％橄欖油的溶液)，并于24小時之后以肉眼和組織學方式評估。以此種方式誘發(fā)的接觸性皮炎的組織學特征(Giemsa染色)在于，在表皮部位明顯形成浮腫和海綿層水腫(spongiosis)，凋亡細胞的增加以及白細胞大量侵潤(圖8)。于末次DNCB暴露1小時之前，皮內(nèi)施用STAT-1-誘餌寡核苷酸(SEQ ID NO19)而非經(jīng)突變的對照寡核苷酸(5’-TGTGGACCGTAGGAAGTG-3’，SEQ ID NO61)，可導致所述的組織學參數(shù)之明顯減低，即總的說來達到了炎癥反應的明顯減弱。
序列表<110>亞文塔克有限公司<120>STAT-1-依賴性基因的表達調(diào)控<130>HEC-003 PCT/nat.
<140>未知<141>2004-04-04<150>DE 101 48 828.9<151>2001-10-04<160>61<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>順式作用元件誘餌<400>36tctcacttac aggaattcac a 21<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>37tgcatattcc tgtaagtg 18<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>38cacttacagg aatatgca 18<210>39<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>39atattcctgt aagtg15
<210>40<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>40cacttacagg aatat15<210>41<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>41taccactgag acatcctgcc ac22<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>42aacatcattg gcacgcag 18<210>43<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>43gtgaacctgc tccag15<210>44<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44cagagttcac tgaaacggaa tgcc 24<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>45tgcctgcctg ttgcacaacc 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46agcaaggcat gatgttaacc 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47gcattcctct cttccagagc 20<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48tcttaatcag tggtggaag19<210>49<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>49tttggtcaag ttgtttcc 18<210>50<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50gtactccaca ttcctacttc tc22
<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51tttgggtcta ttccgttgtg tc22<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52gttcatccgg caccagtcag 20<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53acgtgcacat gagctgccta c 21<210>54<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54gcggatcccc tccagcatga aagtctct 28<210>55<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55acgaattctt cttgggttgt ggagtgag28<210>56<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56gtgcatttcc cgtaaatctt gtc 23<210>57<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>57cacttgataa cagaaagtga taactct 27<210>58<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>58agttgagggg actttcccag gc22<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>59gacagtgcag tgaactgtc19<210>60<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>60catgttatgc agaccgtagt aagtg25<210>61<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌
<400>61tgtggaccgt aggaagtg18
權利要求
1.一種誘餌寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO1至32或34至40的一種序列的一條核酸鏈。
2.權利要求1的誘餌寡核苷酸，其具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵。
3.一種核酸分子，其具有SEQ ID NO41至43的一種序列。
4.權利要求3的核酸分子，其具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵。
5.作為藥物的權利要求1或2的誘餌寡核苷酸和權利要求3或4的核酸分子。
6.權利要求1或2的誘餌寡核苷酸和權利要求3或4的核酸分子作為藥物的用途，所述的藥物用于預防及/或治療心血管并發(fā)癥、特別是在經(jīng)皮血管成形術之后的再狹窄與靜脈搭橋術之后的再狹窄，移植物排異，移植物抗宿主病(GVHD)，在外科介入范疇中的缺血/再注入相關性損傷，免疫學過敏性反應(I至V型)，自身免疫性疾病、特別是糖尿病、多發(fā)性硬化癥和類風濕性關節(jié)炎，所有形式的急性、亞急性和慢性炎性疾病，特別是累及關節(jié)者、特別是關節(jié)炎，累及呼吸器官者、特別是支氣管哮喘和慢性支氣管炎，累及皮膚者、特別是牛皮癬和神經(jīng)性皮炎，以及累及胃腸道者、特別是潰瘍性結腸炎和克隆氏病，以及感染性休克。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO1至43的核酸序列的誘餌寡核苷酸和反義寡核苷酸以及這些寡核苷酸作為藥物的用途。
文檔編號A61P11/06GK1668629SQ02819705
公開日2005年9月14日 申請日期2002年10月2日 優(yōu)先權日2001年10月4日
發(fā)明者馬庫斯·?？? 安德烈·H.·華格納 申請人:亞文塔克有限公司