專利名稱：人體硬組織修復(fù)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用來(lái)刺激骨骼生長(zhǎng)的人體硬組織修復(fù)材料，屬于醫(yī)藥生物發(fā)明領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
骨缺損在臨床上發(fā)病率較高，其治療仍缺乏滿意的骨修復(fù)材料。理想的骨修復(fù)材料應(yīng)具有生物相容性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性及成骨性等特性，自體骨由于具有上述所有特性，所以目前臨床上仍以自體骨移植治療骨缺損為常見，自體骨移植是治療骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是自體骨移植供骨量有限，且手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)供區(qū)組織造成損害，供區(qū)損傷、疼痛等并發(fā)癥高達(dá)25% 30%。異體骨移植盡管避免了自體骨移植對(duì)供區(qū)組織造成的損害，但感染率高，存在引起免疫排斥反應(yīng)的危險(xiǎn)。因此，自體骨和異體骨移植在臨床上應(yīng)用都存在一定的局限。人工合成骨修復(fù)材料在避免上述不利因素的同時(shí)，還具有易進(jìn)行質(zhì)量控制、可標(biāo)準(zhǔn)化批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，成為生物醫(yī)學(xué)材料研究的一個(gè)重點(diǎn)。其中多孔羥基磷灰石(HA)生物陶瓷與人體骨中的無(wú)機(jī)質(zhì)的化學(xué)組成和晶體結(jié)構(gòu)相類似，且具有良好的生物相容性、生物 降解性和骨傳導(dǎo)性，在作為人工骨修復(fù)材料和骨組織工程支架材料方面具有更大的應(yīng)用潛力。然而，現(xiàn)有多孔HA生物陶瓷骨誘導(dǎo)性不足的缺點(diǎn)，使其的應(yīng)用受到較多限制。自體骨中含有的活性成分能夠誘導(dǎo)新骨的形成。人們?cè)诩兓撯}骨基質(zhì)移植物活性成份的研究中發(fā)現(xiàn)了骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)是已知的所有骨生長(zhǎng)因子中對(duì)骨的形成作用最強(qiáng)的因子，可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞、肌源性細(xì)胞等向骨細(xì)胞分化[I]。但BMP-2來(lái)源于動(dòng)物組織，分離純化難且數(shù)量有限。目前，采用基因工程技術(shù)制備的重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (rhBMP-2)已獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)并開始應(yīng)用于臨床，但是，用基因工程技術(shù)生產(chǎn)時(shí)工藝復(fù)雜，難以大規(guī)模生產(chǎn)，成本高，同時(shí)存在基因工程產(chǎn)品潛在的安全性問(wèn)題[2]。最近，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者根據(jù)BMP-2氨基酸序列中發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用的核心功能區(qū)，合成了由20個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該BMP-2活性肽的活性位點(diǎn)能充分暴露并與細(xì)胞表面受體結(jié)合，和BMP-2 —樣具有骨誘導(dǎo)作用，同時(shí)穩(wěn)定性更好，生物活性更強(qiáng)，可用多肽合成儀大規(guī)模合成，費(fèi)用較低[3-6]。如何把BMP-2活性肽通過(guò)結(jié)合載體、支架等釋放系統(tǒng)，在骨缺損部位發(fā)揮骨誘導(dǎo)的作用，也引起了人們的關(guān)注。參考文獻(xiàn)10. P. Gautschi, S. P. Frey and R. Zellweger, Bone morphogenetic proteins inclinical applications. Anz Journal of Surgery,2007. 77 (8) p. 626-631.2. G. B. Bishop and T. A. Einhorn, Current and future clinical applicationsof bone morphogenetic proteins in orthopaedic trauma surgery. InternationalOrthopaedics, 2007. 31 (6) p. 721-727.3. A. Saito，Y. Suzuki, S. Ogata, C. Ohtsuki and M. Tanihara，Accelerated bonerepair with the use of a. synthetic BMP-2-derived peptide and bone-marrowstromal cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A，2005.72A(I)ρ· 77-82.4. A. Saito, Y. Suzuki, S. Ogata, C. Ohtsuki and M. Tanihara, Prolonged ectopiccalcification induced by BMP-2-derived synthetic peptide. Journal of BiomedicalMaterials Research Part A，2004. 70A(I) :p.115-121.5. A. Saito, Y. Suzuki, M. Kitamura, S. I. Ogata, Y. Yoshihara, S. Masuda，C.Ohtsuki and M. Tanihara，Repair of 20-mm long rabbit radial bone defectsusing BMP-derived peptide combined with an alpha—tricalciumphosphate scaffold.Journal of Biomedical Materials Research Part A，2006. 77A(4) p. 700-706.6. A. Saito, Y. Suzuki, S. Ogata, C. Ohtsuki and M. Tanihara，Activation ofosteo-progenitor cells by anovel synthetic peptide derived from the bonemorphogenetic protein_2knuckle epitope.Biochimica Et BiophysicaActa-Proteinsand Proteomics, 2003. 1651 (1-2) p. 60-67.
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發(fā)明內(nèi)容
基于上述研究進(jìn)展，我們?cè)O(shè)想將BMP-2活性肽結(jié)合于HA上，在植入體內(nèi)后，BMP-2活性肽與HA協(xié)同作用，通過(guò)誘導(dǎo)骨組織在孔內(nèi)形成，達(dá)到強(qiáng)化多孔HA種植體、盡早與宿主骨形成牢固結(jié)合的目的。本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有羥基磷灰石骨修復(fù)性能的不足，提供具有促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)速率的磷酸鈣復(fù)合材料。本發(fā)明首先根據(jù)BMP-2氨基酸序列中誘導(dǎo)成骨的核心功能區(qū)，合成了一條含24 28個(gè)氨基酸的BMP-2活性多肽。該羥基磷灰石復(fù)合材料由羥基磷灰石和由SEQ ID NO 1 10所示的氨基酸序列的多肽組成。對(duì)于不同的骨缺損類型，可通過(guò)調(diào)節(jié)多肽與羥基磷灰石的質(zhì)量比，來(lái)控制骨修復(fù)速率，在材料在植入部位的吸收速率與骨骼生長(zhǎng)的速率相匹配。多肽序列為I.EEEEE EEKIP KASSV PTELS AlSTLYL(SEQ ID NO 1)2. KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEEE EE(SEQ ID NO 2)3.EEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO 3)4. KIPKASSVPTELSAISTLYLEEEEEE(SEQ ID NO 4)5. EEEEEE EEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO 5)6. KIPKASSVPTELSAISTLYLEEEEEEEE(SEQ ID NO 6)7.EEEEE KIPKASSVPTELSAISTLYL(SEQ IDNO 7)8. KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEEE(SEQ ID NO 8)9.EEEEKIP KASSV PTELS AISTL YL(SEQ ID NO 9)10. KIP KASSV PTELS AISTL YL EEEE(SEQ ID NO 10)其中所述的BMP-2活性肽，其特征在于由SEQ ID NO :1 10所示的氨基酸序列組成。所述的羥基磷灰石為羥基磷灰石顆粒，線，塊體，支架。同時(shí)本發(fā)明提供一種人體硬組織修復(fù)材料的制備方法，其特征在于包括下述步驟I)將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)活性多肽干粉用生理鹽水溶解或5%葡萄糖溶解；2)將羥基磷灰石顆粒和步驟I)獲得的多肽液相混合；3)將上述混合物靜置，取出支架材料，于超凈工作臺(tái)中快速風(fēng)干，無(wú)菌封存。其中所述步驟I)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)活性多肽溶液濃度為O. 05_20mg/mL，優(yōu)選為0. 5-15mg/ml ;所述步驟2)中多肽與羥基磷灰石的質(zhì)量比為10 1-1 1000，優(yōu)選為I : 1-1 10:所示步驟3)靜置為于25-37°C下靜置，其中靜置時(shí)間可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行本領(lǐng)域常用選擇范圍內(nèi)的調(diào)整，例如10-120min或更長(zhǎng)，常用為60min。其中所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO :1 10所示。本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了上述羥基磷灰石復(fù)合材料在制備骨 修復(fù)材料中的用途。
本發(fā)明創(chuàng)造性的將多肽和羥基磷灰石復(fù)合固化而成一種新的骨修復(fù)材料，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)通過(guò)模仿HA結(jié)合蛋白與HA的結(jié)合機(jī)制，在BMP-2活性肽序列的一端加上多聚谷氨酸多肽序列，形成的新多肽既包括BMP-2氨基酸序列中具有骨誘導(dǎo)作用的核心功能區(qū)，又包括多聚谷氨酸多肽序列，通過(guò)多聚谷氨酸多肽序列與多孔HA陶瓷孔壁表面的特異性生物結(jié)合，加強(qiáng)了骨誘導(dǎo)活性肽與多孔HA陶瓷的結(jié)合，從而達(dá)到提高多孔HA陶瓷的骨誘導(dǎo)活性肽的攜帶量并局部穩(wěn)定釋放骨誘導(dǎo)活性肽的目的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，組合物與現(xiàn)有的羥基磷灰石相比，克服了現(xiàn)有的羥基磷灰石不具有骨誘導(dǎo)性的缺點(diǎn)，骨修復(fù)能力更強(qiáng)，是一種安全高效的骨修復(fù)材料。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于一下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中，所述百分含量如無(wú)特殊說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例中使用的各種單位，統(tǒng)一采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例I本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料的制備方法ISEQ ID NO :1 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為20mg/mL。取羥基磷灰石顆粒和多肽液，多肽與羥基磷灰石的質(zhì)量比為10 1，25攝氏度下勻調(diào)和60分鐘，gp得到本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料。實(shí)施例2本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料的制備方法2SEQ ID NO 1 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為lmg/mL.取多肽液滴在羥基磷灰石片上，25攝氏度下靜置60分鐘，再用PBS溶液清洗掉未吸附的多肽，即得到本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料。多肽與羥基磷灰石的質(zhì)量比為I : 1000。實(shí)施例3本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料的制備方法3SEQ ID NO :1 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為O. 05mg/mL.將羥基磷灰石塊體置于多肽液中，37攝氏度下負(fù)壓吸附60分鐘，即得到本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料。多肽與羥基磷灰石的質(zhì)量比為I : 10。實(shí)施例4本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料的制備方法4SEQ ID NO :I 10所示的多肽干粉用去離子水溶解，濃度為O. 5mg/mL.將羥基磷灰石多孔支架置于多肽液中，37攝氏度下負(fù)壓吸附60分鐘，即得到本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料。多肽與羥基磷灰石的質(zhì)量比為I : 5。實(shí)施例5多肽與羥基磷灰石親和力實(shí)驗(yàn)以多肽B和多肽C為例，通過(guò)體外吸附試驗(yàn)來(lái)研究多肽與羥基磷灰石的親和力。使用FITC標(biāo)記多肽。分組多肽A :FITC-KIP KASSV PTELS AISTLYL (對(duì)照)，多肽 B :FITC_EEEEE EKIPKASSV PTELS AISTLYL (SEQ ID NO :3)，多肽 C :FITC_EEEEEEEE KIP KASSV PTELS AISTLYL (SEQ ID NO :5)。方法將100微克羥基磷灰石顆粒(直徑10-15微米，比表面積為62m2/g)，加入200微升pH值為7. 4的Tris-HCl緩沖液中，配置成懸浮液。將多肽加入懸浮液中，25攝氏度溫度下攪拌I小時(shí)，然后將懸浮液于5000rpm轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，收集上清液測(cè)量未吸附的多肽量。多肽量測(cè)量方法為熒光測(cè)定法，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520nm。 結(jié)果多肽A的吸附量為O. 02nmol，多肽B和C的吸附量為O. 9nmol和O. 8nmol,經(jīng)修飾后，吸附量上升了 3500%。多肽與羥基磷灰石親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多肽A在羥基磷灰石上的吸附量明顯小于其它各組。多肽B和多肽C經(jīng)多聚谷氨酸多肽序列修飾后，能夠與羥基磷灰石特異性生物結(jié)合，而與多肽B和C相類似的其他7種經(jīng)過(guò)優(yōu)化的多肽也都具有相類似的特異性結(jié)合活性。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們分析原因如下多孔HA陶瓷與生長(zhǎng)因子結(jié)合力的大小，決定了生長(zhǎng)因子的攜帶量，釋放速度和釋放時(shí)間。在保持生長(zhǎng)因子的活性前提下，可嘗試采取各種手段，包括物理吸附，靜電吸附，化學(xué)鏈接等各種手段來(lái)加強(qiáng)載體與生長(zhǎng)因子的結(jié)合。目前通常采用物理吸附的方法使多孔HA生物陶瓷結(jié)合生長(zhǎng)因子，臨床研究發(fā)現(xiàn)，這種承載生長(zhǎng)因子的方式，不僅載藥量有限，而且生長(zhǎng)因子的釋放速率不易控制，存在初期釋放過(guò)快，后期釋放量太少的問(wèn)題，無(wú)法實(shí)現(xiàn)持續(xù)釋放，生長(zhǎng)因子在早期超生理劑量釋放，可能引起對(duì)其它組織和器官不必要的副作用，而在后期又很難維持其作用的效果?；瘜W(xué)鏈接的方法可使生長(zhǎng)因子通過(guò)強(qiáng)的化學(xué)結(jié)合力結(jié)合在HA基質(zhì)上，但是對(duì)HA表面化學(xué)處理會(huì)干擾HA吸附有利的血液蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，HA比其它材料植入體具有更高的骨傳導(dǎo)性的原因之一在于其植入體內(nèi)暴露于血液中具有優(yōu)先吸附黏附蛋白的能力，有利于細(xì)胞在其表面的黏附，因此，采用化學(xué)鏈接的方法可能會(huì)影響其本身的骨傳導(dǎo)性。我們模仿HA結(jié)合蛋白與HA的結(jié)合機(jī)制，在BMP-2活性肽序列的一端加上多聚谷氨酸多肽序列，形成的新多肽既包括BMP-2氨基酸序列中具有骨誘導(dǎo)作用的核心功能區(qū)，又包括多聚谷氨酸多肽序列，通過(guò)多聚谷氨酸多肽序列與多孔HA陶瓷孔壁表面的特異性生物結(jié)合，加強(qiáng)了骨誘導(dǎo)活性肽與多孔HA陶瓷的結(jié)合，從而達(dá)到提高多孔HA陶瓷的骨誘導(dǎo)活性肽的攜帶量并局部穩(wěn)定釋放骨誘導(dǎo)活性肽的目的。實(shí)施例6體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)采用大鼠皮下異位成骨模型來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料的骨修復(fù)效果。I、實(shí)驗(yàn)樣品制備與分組成年雌性Wistar大鼠36只，體重80 IOOg,隨機(jī)分成3組,每組12只。按4周和8周2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。實(shí)驗(yàn)材料A組通過(guò)FMOC/tBU固相多肽合成法(現(xiàn)有常規(guī)方法)合成多肽SEQID NO 1 10，所得粗肽經(jīng)過(guò)凝膠層析初步純化，最后經(jīng)過(guò)高效液相色譜法純化后濃度為98. 5%，通過(guò)質(zhì)譜儀對(duì)多肽鑒定其序列。所合成之多肽為干粉狀，用去離子水溶解，濃度為5mg/mL，0.2ym濾膜過(guò)濾除菌后，注射入大鼠皮下。注射過(guò)程采用ImL注射器和26號(hào)針頭。每個(gè)多肽序列每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。實(shí)驗(yàn)材料B組按實(shí)施例4的方法用多肽SEQ ID NO : I 10制備骨修復(fù)材料，大小為直徑IOmm,厚2mm的多孔圓片。手術(shù)置入大鼠皮下。每個(gè)多肽序列每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。實(shí)驗(yàn)材料C組取B組同樣的羥基磷灰石多孔圓片手術(shù)置入大鼠皮下。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只大鼠。2、大體觀察觀察術(shù)后動(dòng)物飲食、活動(dòng)及傷口愈合情況。取材時(shí)觀察植入部位成骨情況和材料·形貌。3、觀測(cè)新骨形成量將植入材料和周圍的組織取出，2. 5%戊二醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精一伊紅染色(H&E)，觀察新骨的形成。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)origins. O軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析功能完成。P < O. 05為差異有顯著性。5、結(jié)果所有植入?yún)^(qū)傷口愈合良好，無(wú)紅腫感染等術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生。A組術(shù)后4周和8周，皮下未見硬組織生成，未見炎性反應(yīng)，組織正常。B組組織切片觀察顯示植入4周后，大量細(xì)胞長(zhǎng)入材料，有小的新生骨小梁形成，材料部分降解。8周時(shí)材料部分降解，有小的新生骨小梁形成，大量成骨細(xì)胞貼附在新生骨小梁邊緣。與4周時(shí)相比，8周時(shí)骨量明顯增多，通過(guò)對(duì)連續(xù)組織切片的計(jì)算得到骨形成區(qū)占切片總面積的百分比分別為4周10%，8周25%。C組術(shù)后4周，植入材料周圍組織內(nèi)可見少量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，材料未完全降解，被結(jié)構(gòu)疏松的纖維囊包裹。術(shù)后8周，植入材料周圍組織內(nèi)未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維囊壁變薄。未見明顯骨組織生成。異位成骨實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，A組是單純的多肽溶液，但注射入皮下后多肽溶液會(huì)擴(kuò)散至周邊組織，多肽失活，未起到異位成骨的效果。B組由多肽和羥基磷灰石支架復(fù)合而成，多肽隨著羥基磷灰石基質(zhì)的降解而逐步釋放，誘導(dǎo)皮下組織細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，分泌骨基質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)其具有異位成骨的效果。實(shí)驗(yàn)材料C是羥基磷灰石多孔圓片，與其它文獻(xiàn)結(jié)果一致，不具有異位成骨作用。實(shí)施例7骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)采用兔股骨踝臨界骨缺損模型來(lái)評(píng)價(jià)本發(fā)明所述的骨修復(fù)材料的骨修復(fù)效果。I、動(dòng)物模型新西蘭兔橈骨中段臨界骨缺損。2、實(shí)驗(yàn)樣品制備與分組實(shí)驗(yàn)材料A組通過(guò)FMOC/tBU固相多肽合成法(現(xiàn)有常規(guī)方法)合成多肽(KIPKASSVPT ELSAI STLYL)，所得粗肽經(jīng)過(guò)凝膠層析初步純化，最后經(jīng)過(guò)高效液相色譜法純化后濃度為98. 5%，通過(guò)質(zhì)譜儀對(duì)多肽鑒定其序列。所合成之多肽為干粉狀，用去離子水溶解，濃度為5mg/mL，0. 2μπι濾膜過(guò)濾除菌后，注射入大鼠皮下。注射過(guò)程采用ImL注射器和26號(hào)針頭。實(shí)驗(yàn)材料B組按實(shí)施例4的方法制備骨修復(fù)材料，大小為直徑5mm，高15mm的多孔支架。實(shí)驗(yàn)材料C組取B組同樣的羥基磷灰石多孔支架。對(duì)照組D :骨缺損空置。按4周，8周和12周3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只兔子，其中3只右下肢植入實(shí)驗(yàn)材料A，左下肢植入實(shí)驗(yàn)材料B ;另外3只右下肢植入實(shí)驗(yàn)材料C，左下肢骨缺損空置。3、觀察指標(biāo)3. I大體觀察 觀察術(shù)后兔子的活動(dòng)、飲食和二便情況，傷口有無(wú)腫脹，有無(wú)分泌物等。3. 2X 線檢查術(shù)后4周,8周和12周連續(xù)X線攝片觀察骨缺損修復(fù)情況，并參照Lane-Sandhu的X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。3. 3生物力學(xué)檢查術(shù)后12周處死動(dòng)物，將樣本平置于萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)操作臺(tái)上進(jìn)行生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)。3. 4觀測(cè)新骨形成量標(biāo)本取下后，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用10% EDTA脫鈣。標(biāo)本常規(guī)脫水，浸蠟，包埋，石蠟切片，行HE染色，光鏡觀察材料及周圍組織的變化和植入材料內(nèi)新骨形成的情況。采用計(jì)算機(jī)多功能圖像分析系統(tǒng)，對(duì)術(shù)后8周和12周的股骨植骨區(qū)的成骨情況進(jìn)行定量分析，各組在不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取3個(gè)平面，每個(gè)平面隨機(jī)選取3個(gè)不重疊的視野進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算新骨生成面積與骨缺損面積的百分比，取其平均數(shù)。3. 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)origins. O軟件的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析功能完成。P < O. 05為差異有顯著性。4 結(jié)果4. I術(shù)后兔子生命活動(dòng)觀察術(shù)后Ih兔子蘇醒，3h后進(jìn)水進(jìn)食，創(chuàng)面無(wú)感染。在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，所有兔子都存活，無(wú)手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生。4. 2X 線觀察實(shí)驗(yàn)材料A組12周內(nèi)骨缺損未修復(fù)，僅在缺損區(qū)邊緣有少量新骨形成。實(shí)驗(yàn)材料B組骨缺損在術(shù)后4周時(shí)界面模糊，材料與缺損邊緣處出現(xiàn)高密度的新生骨組織，術(shù)后8周時(shí)原有缺損部位被大量高密度新生骨組織填充，已無(wú)法分辨植入材料的輪廓及原有缺損部位，術(shù)后12周骨缺損完全修復(fù)，原有骨缺損的密度與正常骨組織密度接近。實(shí)驗(yàn)材料C組骨缺損在術(shù)后4周時(shí)材料外形較易分辨，材料與骨界面處有高密度新生骨組織出現(xiàn)，術(shù)后8周有較多高密度新生骨組織生成，但其輪廓與骨缺損部位仍可分辨，術(shù)后12周，骨缺損區(qū)域被部分新生骨組織填充，其密度稍高于正常骨組織。對(duì)照組D12周內(nèi)骨缺損未修復(fù)，僅在缺損區(qū)邊緣有少量新骨形成。
4. 3Lane_Sandhu 的 X 線評(píng)分結(jié)果4. 4壓縮強(qiáng)度術(shù)后12周各組骨缺損區(qū)壓縮強(qiáng)度如表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)材料B組顯著高于實(shí)驗(yàn)材料C組(P < O. 05)，實(shí)驗(yàn)材料B組和C組均顯著高于對(duì)照組D (P < O. 05)。表I術(shù)后12周各組骨缺損區(qū)壓縮強(qiáng)度
權(quán)利要求
1.一種人體硬組織修復(fù)材料，其特征在于它包括羥基磷灰石與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2ΦΜΡ-2)活性多肽構(gòu)成，具有三維多孔的結(jié)構(gòu)特征。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人體硬組織修復(fù)材料，其特征在于所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO :1 10所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的人體硬組織修復(fù)材料，其特征在于所述的羥基磷灰石形態(tài)為顆粒、線、塊體、支架的一種或組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的人體硬組織修復(fù)材料，其特征在于所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的濃度為O. 05-20mg/mL，其通過(guò)吸附結(jié)合到支架材料上。
5.一種人體硬組織修復(fù)材料的制備方法，其特征在于包括下述步驟 1)將骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)活性多肽干粉用生理鹽水溶解或5%葡萄糖溶解； 2)將羥基磷灰石顆粒和步驟I)獲得的多肽液相混合； 3)將上述混合物靜置，取出支架材料，于超凈工作臺(tái)中快速風(fēng)干，無(wú)菌封存。
6.權(quán)利要求5所述的制備方法，其中所述步驟I)中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)活性多肽溶液濃度為O. 5-2mg/mL;所述步驟2)中多肽與羥基磷灰石的質(zhì)量比為10 1-1 1000 ；所示步驟3)靜置為于25-37°C下靜置。
7.權(quán)利要求5或6所述的制備方法，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)活性多肽的序列由SEQ ID NO 1 10所示。
8.利用權(quán)利要求5-7之一所述的制備方法制備出的人體硬組織修復(fù)材料。
9.權(quán)利要求1-4之一或權(quán)利要求8所述的人體硬組織修復(fù)材料在制備骨修復(fù)材料中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域。主要適用于制取骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽與羥基磷灰石復(fù)合劑型。其中所述的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽，其序列如SEQ ID N01～10所示。本發(fā)明所述的方法首先是將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽溶于生理鹽水溶解或5％葡萄糖溶液中，隨后將羥基磷灰石支架也加入其中，使骨形態(tài)發(fā)生蛋白2活性肽結(jié)合在羥基磷灰石顆粒的表面，經(jīng)離心分離，并清洗干燥后，獲得所需的骨形態(tài)發(fā)生蛋白與羥基磷灰石復(fù)合劑型，即得到本發(fā)明所述的人體硬組織修復(fù)材料。
文檔編號(hào)A61L27/46GK102886075SQ201210347179
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者黃智 , 于博, 周科朝, 張斗, 李志友, 劉正春 申請(qǐng)人:中南大學(xué)