專利名稱：一種治療脈管炎的毛冬青提取物及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療脈管炎的中藥有效部位及其制劑和制備方法，具體說(shuō)是從藥用植物毛冬青(Ilex pubescens Hook Et Arm)中提取分離的治療脈管炎的有效部位及其制劑，及其可工業(yè)化應(yīng)用的提取分離方法。
背景技術(shù)：
血管閉塞性脈管炎是慢性周圍血管性疾病中最常見(jiàn)的一種慢性閉塞性炎癥，伴有繼發(fā)性神經(jīng)改變。主要發(fā)生于四肢的中、小動(dòng)、靜脈，尤以下肢為多見(jiàn)，極少數(shù)發(fā)生于腦、心、消化道等處的血管，臨床癥狀為患肢缺血、疼痛、間歇性跛行、受累動(dòng)脈搏動(dòng)減弱或消失，伴有游走性血栓性淺表靜脈炎，嚴(yán)重者有肢端潰瘍或壞死。目前關(guān)于本病的發(fā)病原因還不是十分清楚，其發(fā)病機(jī)制和病理學(xué)改變又十分復(fù)雜，目前治療藥物和治療手段都比較欠缺。國(guó)外采用交感神經(jīng)節(jié)切除術(shù)，腎上腺合并交感神經(jīng)節(jié)切除術(shù)，血管重建手術(shù)或高位截肢等手術(shù)治療，但其治療價(jià)值一直存在著爭(zhēng)議。西藥治療常用右旋糖酐、妥拉唑林、煙酸等緩解動(dòng)脈痙攣、擴(kuò)張血管，使血小板解聚或動(dòng)脈內(nèi)注射溶栓藥物或激素、亞甲藍(lán)、普魯卡因、前列腺素E或抗炎鎮(zhèn)痛藥等近期療效藥物，但以上治療方法都存在著毒副作用大，療效不太理想的缺點(diǎn)。
中醫(yī)藥在古籍中就有關(guān)于“脫疽”的治療記載，臨床也常有用中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合治療本病的報(bào)道，但大多數(shù)以中藥煎劑為主。
中藥毛冬青是冬青科，冬青屬多年生植物，廣泛生長(zhǎng)于我國(guó)南方各省，我國(guó)民間用其治療血栓閉塞性脈管炎，并取得較好療效，在上世紀(jì)八十年代就引起人們廣泛關(guān)注，我國(guó)中山醫(yī)院、中科院藥物研究所及日本學(xué)者對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行了較深入的研究，先后分離鑒定了五種三萜類皂苷，他們所研究的有效成分毛冬青甲素(Alexonin A)，化學(xué)結(jié)構(gòu)式未公開(kāi)發(fā)表[藥學(xué)通報(bào)19(2)，1984]，大量的基礎(chǔ)藥理及臨床實(shí)驗(yàn)表明它有對(duì)抗血栓形成作用，能降低心肌耗氧量，并有一定的抗炎作用。但自1984年報(bào)道以來(lái)，至今仍未上市。中國(guó)藥典(1977年版)記載毛冬青有涼血活血、通脈、消炎、解毒功能，主治血栓閉塞性脈管炎，冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病。毛冬青已有多種制劑，如片劑、小針劑、膠囊劑、糖漿劑等用于臨床上治療冠狀病、心肌梗塞、缺血性心臟病、周圍血管病、中心性視網(wǎng)膜炎等。經(jīng)查新結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有利用毛冬青提取物總皂苷含量＞50％制成治療心血管疾病、血栓閉塞性脈管炎制劑的報(bào)道。目前只有毛冬青粗提取物或與其它中藥混合制成制劑用于治療心血管疾病的藥物。顯然已有的這些制劑都比較粗，質(zhì)量難以控制，與目前中藥現(xiàn)代化的要求相差甚遠(yuǎn)，對(duì)疾病的治療針對(duì)性也不夠強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是為脈管炎、尤其是血栓閉塞性脈管炎病人研究出更具備針對(duì)性的治療藥物，以便更加準(zhǔn)確地對(duì)癥治療，從而提高對(duì)脈管炎的治療效果。本發(fā)明的另一目的是公開(kāi)一種治療脈管炎、尤其是血栓閉塞性脈管炎的高活性成分含量的毛冬青有效部位及其制劑。
本發(fā)明通過(guò)藥理試驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)總皂苷為毛冬青的一個(gè)有效部位，其抗血小板聚集及抗栓作用表明在脈管炎病變的多個(gè)環(huán)節(jié)上都有治療作用。
本發(fā)明同時(shí)采用高效液相色譜法對(duì)毛冬青總皂苷提取物中毛冬青皂苷B1和毛冬青皂苷甲(Ilexgenin)A兩化合物進(jìn)行了含量測(cè)定，使其質(zhì)量可控，為本發(fā)明向現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)轉(zhuǎn)化創(chuàng)造了必要條件。
本發(fā)明的毛冬青總皂苷提取物按如下方法制備的取毛冬青藥材粉碎，加6-10倍量水或親水性溶劑回流熱提1-3次，每次1～4小時(shí)，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2～4倍量，靜置0～36小時(shí)，過(guò)濾，收集沉淀，備用；母液繼續(xù)濃縮，調(diào)整相對(duì)密度至1～1.3，過(guò)濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入40-95％親水性溶劑，使其溶解，干燥，制得浸膏狀的毛冬青總皂苷提取物。
上述制備方法的條件，其特征在于(1)、濃縮方法可以是常壓下濃縮，也可以是減壓濃縮，減壓濃縮條件為0.01-0.09MPa，40-90℃；(2)回收乙醇方法可以是常壓回收，也可以是減壓回收，減壓回收乙醇條件為0.01-0.09MPa，30-80℃；(3)干燥方法可以是接觸干燥、氣流干燥、隧道式烘箱干燥、真空(減壓)干燥、沸騰干燥、噴霧干燥、冷凍干燥、遠(yuǎn)紅外干燥、微波干燥。
本發(fā)明的毛冬青提取物由毛冬青(Ilex pubescens Hook Et Arm)中提取分離的有效部位組成，其總皂苷含量≥50％，可用于脈管炎、尤其是血栓閉塞性脈管炎。(疾病范圍太大，而且無(wú)藥效實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)補(bǔ)充)優(yōu)選，本發(fā)明的毛冬青總皂苷中毛冬青皂苷B1的含量≥7％。還優(yōu)選，其中Ilexgenin A的含量≥9％。
本發(fā)明的提取物可與任意藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體混合，制成各種藥劑學(xué)上可接受的制劑。其中優(yōu)選膠囊劑。
本發(fā)明藥的有益特點(diǎn)是(1)、總皂苷的提取工藝一般有水提-有機(jī)溶劑萃取法，水提-大孔吸附樹(shù)脂法，醇提-水轉(zhuǎn)溶-有機(jī)溶劑萃取法，但作為工業(yè)化大生產(chǎn)，存在成本過(guò)高和樹(shù)脂殘留物及環(huán)保等問(wèn)題，我們?cè)诖罅康膶?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇了該方法，同時(shí)對(duì)所得提取物浸膏中總皂苷進(jìn)行含量測(cè)定，方法和結(jié)果如下對(duì)照品溶液的制備精密稱取毛冬青皂苷B1適量，用甲醇溶解制成每1ml含0.11mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取本品適量，精密稱定，用甲醇溶解制成每1ml中含有0.16mg的溶液，即得。
測(cè)定法取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各1ml，分別入具塞試管中，揮去溶劑，取出，放冷，分別加入新鮮配制的5％香草醛冰醋酸溶液0.2ml、高氯酸0.8ml，搖勻，置70℃水浴中加熱15分鐘，立即取出，入冰水浴冷卻后，加入冰醋酸5ml，搖勻，放置1小時(shí)后，以試劑同法操作作為空白。照分光光度法(中國(guó)藥典2000年版一部附錄VB)，在539nm±1nm的波長(zhǎng)分別測(cè)定吸收度，計(jì)算，即得。
經(jīng)方法學(xué)考察，標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.02～0.2mg的范圍內(nèi)呈一近似過(guò)零點(diǎn)的直線，回歸方程為A＝4.3788C-0.0399，相關(guān)系數(shù)r＝0.9998(n＝6)。精密度較好，RSD為0.14％，回收率為99.68％，RSD為2.38％，樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1表1毛冬青總皂苷的測(cè)定結(jié)果

毛冬青中含有黃酮類化合物、酚性化合物和皂苷類化合物，其皂苷類化合物主要有毛冬青皂苷B、B1、B2、B3(Ilexsaponin B、B1、B2、B3)，毛冬青皂苷甲(Ilexgenin A？)，棲冬青苷(Pedunculoside)，Ilexolide A等。
為便本發(fā)明質(zhì)量可控，從而使本發(fā)明順利過(guò)渡到大生產(chǎn)，發(fā)明人對(duì)毛冬青總皂苷提取物中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A？?jī)苫衔镞M(jìn)行了含量測(cè)定研究。
(2)、用本發(fā)明的毛冬青的總皂苷提取物浸膏進(jìn)行藥理試驗(yàn)，具體結(jié)果如下①、抗栓實(shí)驗(yàn)●電刺激大鼠頸總動(dòng)脈致血栓法取清潔級(jí)雄性SD大鼠，雄性，60只，體重250-300g，隨機(jī)分成5組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥(1ml/100g)9天，第10天取大鼠在25±2℃環(huán)境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，電刺激左側(cè)頸總動(dòng)脈(1.2mA、7min)，于BT87-3型實(shí)驗(yàn)性體內(nèi)血栓形成測(cè)定儀上，測(cè)定血栓形成時(shí)間(OT)值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并做組間t檢驗(yàn)。
結(jié)果毛冬青制劑具有延長(zhǎng)動(dòng)脈血栓形成時(shí)間的作用，其中37.5mg/kg劑量組與空白組比較，差異有顯著意義(P＜0.05)75及150mg/kg劑量組與空白組比較，差異有非常顯著意義(P＜0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2毛冬青制劑對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成時(shí)間的影響(X±SD)

與空白組比*P＜0.05**P＜0.01●結(jié)扎大鼠下腔靜脈致血栓法取雄性清潔級(jí)SD大鼠50只，體重為250-300g，隨機(jī)分為5組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥(1ml/100g)14天，第15天取大鼠在25±2℃環(huán)境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，打開(kāi)腹腔，分離下腔靜脈。于左腎靜脈下方結(jié)扎下腔靜脈。爾后縫合手術(shù)傷口。結(jié)扎3小時(shí)后，重新打開(kāi)腹腔，在結(jié)扎線下方2cm處，用止血鉗夾閉血管，并將此段血管各分枝血管結(jié)扎。用注射器抽干血液，剖開(kāi)血管，用鑷子小心夾出血栓，并在濾紙上吸盡殘血，2min后在電子天秤上稱血栓濕重。統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)，并做組間t檢驗(yàn)。
結(jié)果毛冬青制劑具有對(duì)抗靜脈血栓形成的作用，其中37.5、75mg/kg劑量組與空白組比較，差異有非常顯著意義(P＜0.01)，150mg/kg劑量組與空白組比，差異有顯著意義(P＜0.05)，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3毛冬青制劑對(duì)大鼠下腔靜脈血栓形成的影響(X±SD)

與空白組比較*P＜0.05**P＜0.01②、血漿優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間(ELT)，血漿凝血酶原時(shí)間(PT)，部分凝血酶時(shí)間(AKPTT)的測(cè)定取清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，200-250g，隨機(jī)分成5組，每組10只，連續(xù)灌胃給藥(1ml/100g)14天，第15天取已禁食12hr的大鼠于25±2℃環(huán)境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，腹主動(dòng)脈取血4.5ml，用0.5ml，3.28％構(gòu)椽酸鈉抗凝。于4℃冰箱內(nèi)，3000r離心10min，取血漿0.5ml置于TYXN-91A智能血液凝集儀上，37℃預(yù)熱5min后，測(cè)定PT，AKPTT值。另取血漿1ml，分成兩份，每份0.5ml，分別加入內(nèi)置4℃，9ml0.011％乙酸液的錐形離心管中，混勻。靜置30min后，3000r離心5min，傾出上清液，并將離心管倒置于濾紙上，吸干余液，爾后將離心管置于37℃水浴中加入0.5ml四硼酸鈉液(pH＝9)，溶解沉淀。再加入0.025M CaCl2液0.5ml，混勻。約2-3min后，管內(nèi)液體開(kāi)始凝固，記錄從形成凝塊至完全溶解的時(shí)間(min)，即ELT值。統(tǒng)計(jì)各組數(shù)據(jù)，并做組間t檢驗(yàn)。
結(jié)果毛冬青制劑具有加速纖維蛋白溶解的作用，對(duì)內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)則無(wú)作用(P＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)表4。
表4毛冬青制劑對(duì)ELT、PT、AKPTT的影響(X±SD)

與空白組比較*P＜0.05**P＜0.01③、對(duì)血小板聚集性的影響取清潔級(jí)雄性SD大鼠60只，200-250g，隨機(jī)分成5組，每組10只，連續(xù)灌胃給藥(1ml/100g)6天，第7天取已禁食12hr的大鼠于25±2℃環(huán)境中，灌胃給藥30min后，50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，固定，腹主動(dòng)脈取血4.5ml，用0.5ml 3.28％枸椽酸鈉1∶9抗凝，制取PRP及PPP。
將各管血漿，于TYXN-91A型智能血液凝集儀上，測(cè)5min內(nèi)血小板最大聚集率，所用誘導(dǎo)劑為ADP(5uM)，膠原(5ul)，花生四烯酸(10ul)，統(tǒng)計(jì)各組結(jié)果，并做組間t檢驗(yàn)。
結(jié)果毛冬青制劑能對(duì)抗ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集(P＜0.05及0.01)，起效劑量為37.5mg/kg。不能對(duì)抗膠原誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集(P＞0.05)，不能對(duì)抗花生四烯酸誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集(P＞0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5-1、2、3。
表5-1毛冬青制劑對(duì)膠原誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率的影響(X±SD)

與空白組比較p＞0.05
表5-2毛冬青制劑對(duì)ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率的影響(X±SD)

與空白組比較*P＜0.05**P＜0.01表5-3毛冬青制劑對(duì)花生四烯酸誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集率的影響(X±SD)

與空白組比較p＞0.05④、對(duì)動(dòng)脈壁前列環(huán)素(PGI2)活性的影響[9]取清潔級(jí)雄性SD大鼠50只，250-300g。隨機(jī)分成5組，每組10只。麻醉，固定，舌靜脈注射給藥(0.2ml/100g)30min后，迅速開(kāi)胸剪下胸主動(dòng)脈置于冰冷-中剝離周圍結(jié)締組織，切成約2mm小段，稱重，加入磷酸緩沖液(1ml/4mg)，于37℃水浴中溫育30min后，取出組織，放入冰浴中終止反應(yīng)。爾后取10ul溫育液，采用放免法測(cè)定PGI2代謝產(chǎn)物6-Keto-PGF1a含量以此作指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)，并做組間t檢驗(yàn)。
結(jié)果毛冬青制劑具有增強(qiáng)PGI2活性的作用(P＜0.05)，起效劑量為37.5mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表6。
表6毛冬青制劑對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈壁PGI2活性的影響(X±SD)

與空白組比*P＜0.05**P＜0.01⑤、小鼠耳腫脹試驗(yàn)取雄性清潔級(jí)昆明種鼠60只，體重為18-20g，按體重隨機(jī)分為6組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥(0.2ml/10g)2天，第3天取小鼠在25±2℃環(huán)境中，灌胃給藥30min后，在小鼠左耳涂抹二甲苯25ul，待30min后處死小鼠，剪下雙耳，用直徑為8mm的子彈殼沿耳緣切跡打孔，分別稱重，以每只小鼠的左耳重量減去右耳重量的差值作為腫脹度，統(tǒng)計(jì)，并做組間t檢驗(yàn)。
結(jié)果與模型組比較，阿司匹林組及毛冬青制劑75，150mg/kg劑量組有減輕小鼠耳腫脹度的作用，差異有顯著性意義(p＜0.05及0.01)。結(jié)果見(jiàn)表7。
表7毛冬青制劑對(duì)小鼠耳腫脹的影響(X±SD)

與模型組比*P＜0.05**P＜0.01。
通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察，本品經(jīng)灌胃給藥后，可見(jiàn)其有抗栓作用，這與其抗血小板聚集、促進(jìn)纖溶及促進(jìn)PGI2的釋放有關(guān)，同時(shí)本品還具有減輕急性炎癥的發(fā)生。由此可見(jiàn)，本品在脈管炎病變的多個(gè)環(huán)節(jié)上都有治療作用，綜上所述，本品不失為治療脈管炎的良藥。
實(shí)施例1取毛冬青藥材粉碎，加6倍量60％乙醇回流熱提1次，時(shí)間2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2倍量，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集沉淀，備用；母液繼續(xù)濃縮，調(diào)整相對(duì)密度至1.05(25-28℃)，過(guò)濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入60％乙醇，使其溶解，干燥，制得總皂苷含量為75％的浸膏，其中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A的含量分別為7.35％、9.47％。
實(shí)施例2取毛冬青藥材粉碎，加8倍量80％乙醇回流熱提2次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2倍量，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集沉淀，備用；母液繼續(xù)濃縮，調(diào)整相對(duì)密度至1.05(25-28℃)，過(guò)濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入80％乙醇，使其溶解，干燥，制得總皂苷含量為79％的浸膏，其中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A的含量分別為9.45％、12.72％。
實(shí)施例3取毛冬青藥材粉碎，加10倍量80％乙醇回流熱提3次，每次2小時(shí)，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2倍量，靜置24小時(shí)，過(guò)濾，收集沉淀，備用；母液繼續(xù)濃縮，調(diào)整相對(duì)密度至1.05(25-28℃)，過(guò)濾，收集沉淀，備用。合并沉淀，加入80％乙醇，使其溶解，干燥，制得總皂苷76％的浸膏，其中毛冬青皂苷B1和Ilexgenin A的含量含量分別為8.89％、12.55％。
實(shí)施例4取毛冬青提取物浸膏1份，聚乙二醇1.5份，加10倍量80％乙醇，加熱回流2～4小時(shí)，回收溶劑干燥，粉碎，制成膠囊。
實(shí)施例5取毛冬青提取物浸膏1份，聚乙二醇2份，加15倍量95％乙醇，加熱回流1～3小時(shí)，減壓回收溶劑，干燥，粉碎，制成膠囊。
實(shí)施例6取毛冬青提取物浸膏1份，聚乙二醇3份，加20倍無(wú)水乙醇，加熱回流1～5小時(shí)，回收溶劑，干燥，粉碎，制成膠囊。
權(quán)利要求
1.一種治療脈管炎的毛冬青提取物，其特征在于它是由以下方法制備而成的取毛冬青藥材粉碎，加6-10倍量水或40-95％親水性溶劑回流熱提1-3次，每次1～4小時(shí)，合并提取液，回收溶劑至約原藥材2～4倍量，靜置0～36小時(shí)，過(guò)濾，收集沉淀，備用；母液繼續(xù)濃縮，調(diào)整相對(duì)密度至1～1.3，過(guò)濾，收集沉淀，備用，合并沉淀，加入40-95％親水性溶劑，使其溶解，干燥，制得浸膏狀的毛冬青提取物。
2.利要求1所述的毛冬青提取物，其中含總皂苷≥50％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛冬青提取物，其中總皂苷中毛冬青皂苷B1的含量≥7％。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的毛冬青提取物，其中總皂苷中毛冬青皂苷甲A的含量≥9％。
5.一種治療脈管炎的毛冬青制劑，其特征在于由權(quán)利要求1-4所述的任一毛冬青提取物與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的毛冬青制劑，其特征在于該制劑為膠囊。
7.權(quán)利要求6所述制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟取毛冬青提取物和聚乙二醇3份，加入乙醇，加熱回流1～5小時(shí)，回收溶劑，干燥，粉碎，制成膠囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療脈管炎的中藥有效部位及其制劑和制備方法，具體說(shuō)是從藥用植物毛冬青(Ilex pubescens Hook Et Arm)中提取分離的治療脈管炎的有效部位及其制劑，以及可工業(yè)化應(yīng)用的提取分離方法。本發(fā)明特征在于所公開(kāi)的中藥提取物，其總皂苷含量≥50％；該提取物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體混合，制成各種藥劑學(xué)上可接受的制劑。本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提取物總皂苷為毛冬青的一個(gè)有效部位，其抗血栓、抗血小板聚集及消炎鎮(zhèn)痛作用表明在脈管炎尤其是血管閉塞性脈管炎病變的多個(gè)環(huán)節(jié)上都有治療作用。
文檔編號(hào)A61K9/48GK1781503SQ200410097759
公開(kāi)日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月29日
發(fā)明者曾憲儀, 郭晟, 陳新菊, 鐘小群, 利家平, 徐曉艷, 鄭國(guó)安, 李萍 申請(qǐng)人:江西省藥物研究所