專利名稱：microRNA-1的反義鎖核苷酸序列在制備預防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸類物質(zhì)在制備預防或治療疾病藥物中的應用，特別涉及 microRNA-1的反義鎖核苷酸序列在制備預防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應用，本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心衰是心肌梗死后發(fā)生猝死的重要原因。心臟疾病發(fā)病機制錯綜復雜，每一種發(fā)病機制可導致一種或多種疾病的表現(xiàn)形式，而多種疾病的表現(xiàn)形式可能由單一發(fā)病機制所導致，這給此類疾病的預防和治療帶來難度。因此目前為止針對單一靶點的藥物治療，尚不能達到讓人滿意的效果。隨著近來microRNAs研究的興起，這種內(nèi)源性的非編碼小RNAs已經(jīng)作為一個基因表達調(diào)控的關(guān)鍵因子參與許多重要的生理過程。由于單一的microRNA可負向調(diào)控多個基因mRNA的表達，使得以關(guān)鍵microRNA為靶點的藥物可通過調(diào)節(jié)多個參與心臟疾病發(fā)生的基因的表達，從而給心臟疾病的防治帶來新的希望，因此發(fā)現(xiàn)不同病理生理情況下起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用的microRNA亞型變化，并闡明其功能，將會對該疾病的治療帶來新的靶標和產(chǎn)生新的干預策略。已有研究表明microRNA-Ι作為在肌肉中特異表達的微小 RNA，在心肌梗死患者和冠脈結(jié)扎的心肌組織中高表達。并證明其通過作用于鉀通道蛋白和心肌Cx43參與了心梗后惡性心律失常的發(fā)生。也有研究表明microRNA-Ι在胚胎期可以影響心肌細胞的發(fā)育和分化。然而，microRNA-Ι是否參與了心梗后心衰的發(fā)生和發(fā)展過程， 仍未見報道。因此，本發(fā)明采用多種技術(shù)手段證明microRNA-Ι在心衰發(fā)生發(fā)展中的作用， 并采用最新的鎖核苷技術(shù)研究microRNA-Ι對心衰發(fā)生和發(fā)展的防治作用，最終確定檢測外周血液(全血，血漿，血清)microRNA-Ι是否可以作為一種新的生物標志物預測心梗后心衰的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用多種技術(shù)手段證明了 microRNA-Ι在心衰發(fā)生和發(fā)展中的作用，并將其作為一種新型的藥物作用靶點，以及生物標志物，應用于預防或治療由心肌梗死導致的心衰的治療。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)手段實現(xiàn)的本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)micr0RNA-l在心?；颊咄庵苎核脚c心臟功能呈負相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)microRNA-1 (5，-UAUGUAUGAAGAAAUGUAAGGU-3，)過表達小鼠出現(xiàn)心臟功能的下降。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合具體實驗，發(fā)現(xiàn)了 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸LNA-I (LNA 5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，，SEQ ID NO. 1 所示)可以防止心衰的發(fā)生。LNA-1 可成為一種預防和治療心肌梗死后心衰的治療。因此，本發(fā)明提出了 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸在制備預防或治療心肌梗死后心衰藥物中的應用。
microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑中的應用。通過熒光定量PCR，銀染增強的納米微球技術(shù)檢測病人外周血液(全血，血漿和血清)中microRNA-1的表達水平，用于對缺血性心臟病誘發(fā)心衰的診斷和預防。在本發(fā)明的具體實施例中，所述的microRNA-1的反義鎖核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。利用本發(fā)明的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列制備得到的預防或治療心肌梗死后心衰的藥物，其特征在于有效成分為所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。制備的藥物可以只含microRNA-1，也可通過制成一種藥物組合物的方式實現(xiàn)，其特征在于包含以上所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列及藥學上可接受的載體；其中，所述的載體為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質(zhì)體等，合成HiiR-I并與上述的適當載體連接形成藥物，可制成口服制劑或注射制劑等，通過靜脈或肌肉注射的方式，用于治療和預防心肌梗死后心衰的發(fā)生。例如將microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列與膽固醇連接制備相應的藥物，其制備方法可采用首先化學合成microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列，在其尾端連接膽固醇的常規(guī)核酸制劑的方法；例如將microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列與納米顆粒連接制備相應的藥物，其制備方法可采用化學合成microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列，將其與適宜的納米顆?；旌?， 制成連有microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列的納米顆粒，用于心肌梗死后心衰藥物的制備中。為了增加核酸試劑的使用效果，還可輔以專用的穩(wěn)定劑和特異性免疫增強劑精制而成。一種用于診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑，其特征在于包含所述的 microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。


圖1為心肌梗死患者血漿miR-1水平與心功的相關(guān)性分析；MIH 有心梗病史；AMI 初發(fā)急性心肌梗死圖2為microRNA-Ι轉(zhuǎn)基因小鼠心臟microRNA-Ι表達水平變化；圖3為TG小鼠心電和電鏡檢測；圖4為TG小鼠心臟功能評價；
圖5為TG小鼠心臟形態(tài)學改變；圖6為心肌收縮相關(guān)蛋白在miR-lTG小鼠心臟上的表達；圖7為LNA對TG小鼠心臟功能的影響及分子機制。
具體實施例方式下面通過藥理性及臨床觀察實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。實施例ImicroRNA-I在心衰中的作用以及microRNA-Ι心臟過表達TG小鼠模型的
4構(gòu)建實驗材料C57B/L6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司1. UmicroRNA-I在心?；颊咄庵苎核脚c心臟功能呈負相關(guān)本實驗選取49例心肌梗死患者的血樣，發(fā)現(xiàn)在初發(fā)急性心肌梗死患者血中 microRNA-1水平與射血分數(shù)(EF)、左心室短軸縮短率(FQ和二尖瓣口舒張早期峰值速度 (E)與舒張晚期峰值速度(A)的比值呈負相關(guān)，實驗結(jié)果如圖IA-H所示。1. 2、microRNA_l心臟過表達TG小鼠模型的構(gòu)建利用real time PCR檢測TG小鼠各臟器中microRNA-1的表達量，結(jié)果顯示與非轉(zhuǎn)基因小鼠(WT)相比，TG小鼠左心室microRNA-1表達升高了 4倍< 0. 05vs. WT) (圖2A所示)，而骨骼肌未發(fā)生改變(圖2B所示。)，說明本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠是心臟特異性的轉(zhuǎn)基因小鼠。1. 2. UmicroRNA-ITG小鼠進行心臟功能的評價如圖3A所示本發(fā)明應用心電監(jiān)測儀記錄了 12只陽性TG小鼠和12只WT小鼠的心電變化，結(jié)果顯示從出生后4個月開始，所有12只陽性TG小鼠均出現(xiàn)P-R間期和QRS波群的增寬。表明TG小鼠出現(xiàn)傳導阻滯。圖;3B電鏡觀察表明心肌組織出現(xiàn)明顯閏盤的溶解， Western檢測進一步證明與同齡的WT小鼠相比較，影響閏盤組織結(jié)構(gòu)的的關(guān)鍵蛋白Cx43在 TG小鼠心臟表達明顯下降。隨后本發(fā)明采用心臟超生和壓力容積環(huán)的方法對TG小鼠的心功進行了評價。如圖4A-I所示與同齡WT小鼠相比較TG小鼠的心臟功能隨年齡的增加而下降。主要表現(xiàn)在 EF%，ESP，士dp/dt，PRSW 禾口 τ 的下降和 EDP、ESV 的下降。1. 2. 2、microRNA-1 TG小鼠心臟形態(tài)學評價通過對小鼠正常組、microRNA-lTG小鼠2，4，6個月組的心臟/體重進行比較，發(fā)現(xiàn)與同齡WT小鼠比較，6個月TG小鼠表現(xiàn)出心臟/體重的增大(圖5A&B)。HE染色觀察并未發(fā)現(xiàn)心肌細胞的肥大(圖5C&D)。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)2，4，6個月TG小鼠均表現(xiàn)出明顯的肌肉收縮不規(guī)則，進一步的定量分析發(fā)現(xiàn)TG小鼠肌節(jié)長度呈現(xiàn)長短不一的現(xiàn)象(圖5E， F&G)。圖5E亦顯示6各月TG小鼠心肌組織出現(xiàn)明顯的壞死樣變化。1. 2. 3、microRNA-1 TG小鼠心肌相關(guān)蛋白MLC2v和CaM表達下降實驗采用Wfestern blot的方法發(fā)現(xiàn)microRNA-lTG小鼠心肌收縮相關(guān)蛋白MLC2v、 cMyBP-C和CaMKII的磷酸化水平降低(圖6A、B、E)。進一步研究發(fā)現(xiàn)是由于cMLCK和CaM 表達下降引起的(圖6C、D、F和G)。實施例2microRNA-l反義鎖核苷酸(LNA)的合成以及LNA對microRNA-lTG小鼠心臟功能和蛋白的影響2. UmicroRNA-I反義鎖核苷酸(LNA)的合成采用基因全序列合成的方法合成microRNA-Ι反義鎖核苷酸(LNA)序列，所合成的序列如下所示LNA :5，-ATACATACTTCT TTACATTCCA-3，(SEQ ID NO. 1 所示)。 2.2、LNA-對microRNA-1 TG小鼠心臟功能和蛋白的影響
將LNA用PBS配置成濃度為0. 4mg/ml的液體，采用在體microRNA-Ι反義鎖核苷酸序列(LNA)尾靜脈注射的方法將所合成的反義鎖核苷酸序列注射入TG小鼠體內(nèi)。尾靜脈注射:3mg/kg/次，每隔一周注射一次，共注射3次。在末次注射一周后進行各項指標的檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MiR-I-LNA不僅可以逆轉(zhuǎn)TG小鼠的心臟功能，還能阻止心肌重構(gòu)的進一步發(fā)展(圖7A-D所示)。這一結(jié)果是由于LNA解除了 miR-1對心肌收縮蛋白cMLCK和CaM的抑制作用(圖7E-K所示)。 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備治療或預防心肌梗死后心衰藥物中的應用。
2.microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑中的應用。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應用，其特征在于所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
4.一種用于治療或預防心肌梗死后心衰的藥物組合物，其特征在于有效成分為權(quán)利要求1或3所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物中還進一步包括藥學上接受的載體，所述的載體為病毒、膽固醇、納米顆粒、殼聚糖或脂質(zhì)體。
6.如權(quán)利要求4或5所述的藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物為口服制劑或注射制劑。
7.一種用于診斷缺血性心臟病誘發(fā)的心衰的試劑，其特征在于包含權(quán)利要求2或3所述的microRNA-Ι的反義鎖核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了microRNA-1的反義鎖核苷酸在制備預防和治療心肌梗死后心衰藥物中的應用。制備的藥物可以只含microRNA-1的反義鎖核苷酸序列，也可制成一種藥物組合物，其特征在于包含有效劑量的microRNA-1的反義鎖核苷酸序列及藥學上可接受的載體；其中，所述的載體可為病毒、膽固醇，納米顆粒，殼聚糖，脂質(zhì)體等，合成microRNA-1的反義鎖核苷酸序列并與上述的適當載體連接形成藥物，可制成注射制劑，通過靜脈或肌肉注射的方式，用于治療心肌梗死后心衰的發(fā)生。
文檔編號A61P9/04GK102416184SQ201110405299
公開日2012年4月18日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者呂延杰, 楊寶峰, 艾靜 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學