專利名稱：用白介素-10激活外周血單核細胞的細胞溶解活性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及白介素-10的使用，白介素-10(IL-10)形式上是細胞因子合成抑制因子(CSIF)通過激發(fā)外周血單核細胞(PBMC)的細胞溶解活性而用于腫瘤疾病(癌癥)的繼承性免疫治療上。
背景技術(shù)：
腫瘤治療的免疫療法是基于這樣一個概念癌細胞由于某種還不太清楚的原因而逃脫了機體對于畸變或外源的細胞和分子的防御反應(yīng)而且這種防御反應(yīng)可以通過治療的方法去激活以殺死或抑制癌細胞的生長，例如Klein曾討論過這個問題(Immunology，Wiley-Interscience，1982 pp.623-648)。結(jié)果免疫效應(yīng)子可直接或間接地抑制腫瘤的生長的最近的觀察，使人們對這種治療腫瘤的方法又重新產(chǎn)生了興趣。[Heberman，Concepts Immunopath.196(1985)(natural killercells resist tumor growth)；Rosenberg et al.，Ann.Rev.Immunol.4681(1988)(use of IL-2-activated killer cellls to treat cancerRalf et al.，J.Exp.Med.167712(1988)(tumoricidal activity ofmacrophages stimulated by lymphokines)；Tepper et al.，Cell 57503(1989)(IL-4 has tumoricidal activity)；M.Cohen，“Lymphokines and Tumor Immunity”，pp.237-253，in S.Cohened.，Lymphokines and the Immune Response(CRC Press，Boca Raton，1990)]。
對腫瘤的免疫應(yīng)答性受多種類型細胞的調(diào)控而且還包括T細胞和單核細胞來源的細胞因子的作用。一種臨床有望的免疫治療方法就是應(yīng)用IL-2激活的殺傷細胞的所謂“繼承性免疫療法”。[Rosenberg，Supra Rosenberg，Sci.Am，pp.62-69(May 1990)]。盡管IL-2單獨或與傳統(tǒng)的化療藥物合用在治一些惡性腫瘤時很有效(例如腎細胞癌)，但伴隨著有效劑量的IL-2的使用所帶來的不利的毒副任用例如血管層滲漏和水腫，使有些人提出這種治療方法的危險性已超過了它本身的好處。[Cotran et al.，J Immunol.1391882(1987)；Edwards et al.，Cancer Res.523425(1992)]。
人血管內(nèi)皮細胞對IL-2的毒性特別敏感，表現(xiàn)為血管通透性增加(即血管滲漏綜合癥)和水腫。引起這種病理反應(yīng)的可能因素中的一種是IL-2激活的T細胞和中性粒細胞在血管內(nèi)皮的單細胞層上的粘附作用增強，這一點正如以前在體外所做的工作已證實的那樣[Edwars et al.，Supra；Damle et al.，1381779(1987)]。
另一種對腫瘤疾病的免疫治療的方法是免疫細胞的繼承性轉(zhuǎn)移。繼承性免疫治療的定義是向攜帶腫瘤的宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)移或移植活性免疫藥劑例如可直接或間接介導(dǎo)抗腫瘤作用的具有抗腫瘤活性的細胞。繼承性免疫療法是一個很有吸引力的治療腫瘤疾病的方法。應(yīng)該指出的是由于轉(zhuǎn)入宿主體內(nèi)的是有活性的免疫藥劑，因此并不需要宿主完全的免疫活性。因此，通常由于患腫瘤而引起的免疫抑制在這種免疫療法中并不是主要障礙。由于宿主的免疫活性是不要求的，而且實際上這種情況可能對免疫細胞的繼承性轉(zhuǎn)移是有益的，因此繼承性免疫療法可以很容易地與其它治療方法如化療和放療相結(jié)合使用。而且與其它治療方法不同的是，這種療法可能不會產(chǎn)生免疫抑制作用。
腫瘤病人在化療或放療中勢必引起免疫損傷，而且將常使激活免疫反應(yīng)有效的效應(yīng)子細胞外周血單核細胞(PBMCs)的供應(yīng)減少。在低的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比例條件下就表現(xiàn)效果的治療方法因而將對這樣一些病人是特別有利的。
對腫瘤的免疫反應(yīng)性受多種類型細胞的調(diào)控而且包括T細胞和單核細胞來源的細胞因子的作用。使用重組的人細胞因子的繼承性免疫療法隨著IL-2的使用[Rosenkey et al.，J.Immol 1381779(1985)]已涉及到外周血單核細胞(PBMCs)的體外激活[Philips et al.，J.Clin.Oncd.51933(1987)；Perussia，Carr，Opion Immunol.349(1991)]外周血單核細胞的體外處理產(chǎn)生活化的淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)和激活的自然殺傷細胞(NK)，二者對各種不同的腫瘤細胞都有細胞溶解活性。
已有報道重組的人白介素-5(IL-5)[Nagasawa et al.，Cell.Immunol.133317(1991)]，白介素-7(IL-7)[Stotter and Lotze，Arch.Surgery1261525(1991)]和白介素-12(IL-12)[Gately et al.，J.Immunol.147874(1991)]可以激活人外周血單核細胞的細胞溶解活性。白介素-10(IL-10)最初的報道是在小鼠中由特異的T輔助細胞亞類作為一種細胞因子抑制因子分泌，可調(diào)節(jié)小鼠細胞毒T細胞的分化[Chen and Zlotnik，J.Immunol 147528(1991)]。而且還發(fā)現(xiàn)用從轉(zhuǎn)染有人IL-10 cDNA的COS細胞回收的上清液孵育人外周血單核細胞，經(jīng)孵育的細胞在體外可溶解腫瘤靶細胞。對IL-10起反應(yīng)溶解潛力增強的T細胞，經(jīng)鑒定為一個CD56+表型，說明是自然殺傷(NK)細胞。
有些情況下，IL-4對由IL-2所誘導(dǎo)的LAK活性產(chǎn)生起相反的作用。[Nagler et al.，J.Immunol.1412349(1988)]。例如，如果人外周血單核細胞同時與IL-2和IL-4一起孵育，對LAK敏感的靶細胞溶胞作用大大減少[Spits et al.，J.Immunol.14129(1988)]。但如果PBMCs在加入IL-4之前用補有IL-2的培養(yǎng)基預(yù)先培養(yǎng)3天，細胞的溶解活性都是增加的[Spits et al.，Supra]。而且如果在最初的孵育混合物中包含α-干擾素(α-IFN)或腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，則IL-4對I-2對驅(qū)動的細胞溶解活性的阻斷作用即可減弱[Swisher et al.，Cell.Immunol.128450(1990)]。
Kedar等[Cancer Immunol.Immunother.3563(1992)]最近指出在治療小鼠腫瘤模型MCA-105肉瘤和M10g癌中，IL-2和α-IFN的順序使用是一個有效的免疫治療方式。這項研究的最主要的發(fā)現(xiàn)是細胞因子的順序使用比細胞因子的同時使用有更高的效果。
繼承性免疫療法作為一種治療人類各種疾病尤其是腫瘤(癌癥)的治療模式，它的可行性和效果已在Rosenberg的美國專利；專利號為No.4,690,915中有描述。然而如上指明那樣，需要有實施這樣繼承性免疫療法但又不象單獨使用IL-2時那樣的毒性的方法。還需要有一種在低的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比例的條件下就很有效的治療方式。
發(fā)明概述本發(fā)明滿足了這些要求，提供了IL-10單獨使用或與IL-2合用再和/或與α-IFN合用以增加PBMCs特別是LAK和NK細胞細胞溶解活性的方法。
更特別的是，本發(fā)明提供了一個給癌癥患者使用激活PBMCs的IL-10的有效劑量并使癌癥消退的方法。激活的PBMCs的優(yōu)選實施方案是同時或后續(xù)使用IL-10。
在一種實施方案中是IL-10和IL-2合用，IL-2的量足以增加LAK細胞的活性，但在單獨使用時又不會引起毒副作用。
另一種實施方案是IL-10和足以增加LAK細胞活性量的α-IFN合用。
還有一種實施方案是IL-10和(a)足以增加LAK細胞的活性但在單獨使用時又不引起毒副作用劑量的IL-2一起使用和(b)足以增加LAK細胞活性量的α-IFN一起使用。
本發(fā)明還進一步提供了用內(nèi)源性白介素-4(IL-4)拮抗阻斷由IL-2引起的細胞毒作用的方法，包括給這類病人使用有效劑量的IL-10。
本發(fā)明進一步提供了包括IL-10與IL-2和/或α-IFN合用的藥劑組合物以及藥劑學(xué)上可接受的載體。
在前述的方法和組合物中優(yōu)選使用人的IL-10、IL-2和α-IFN，更優(yōu)選的是使用重組的人IL-10、IL-2，和α-IFN。
發(fā)明詳述此處引用的所有參考文獻都是經(jīng)全盤考慮被編入做為參考的。
本發(fā)明是一個改進應(yīng)用IL-2誘導(dǎo)NK和LAK細胞的細胞溶解活性的現(xiàn)有技術(shù)的方法。本發(fā)明通過完全去除IL-2或大大降低所必需使用的IL-2的劑量而極大的減輕了在使用IL-2的方法中所產(chǎn)生的典型的毒副作用。
除非特別定義，這兒所用的各種術(shù)語和用于指導(dǎo)本發(fā)明在本領(lǐng)域中所熟知的術(shù)語具有相同的含義。
象這兒所用的術(shù)語“繼承性免疫療法”含義即是給病人移植激活的有功能的免疫細胞的治療法。優(yōu)選實施方案是，這些細胞中包括來源于正在接受治療的病人的LAK和NK細胞。
這兒所用的術(shù)語“消退”的含義是和本領(lǐng)域的普通測定一樣，指一個或多個腫瘤體積上的可測量的減小。
這兒所用的“Interleukin-10”或“IL-10”定義是一種蛋白(a)該蛋白是一種氨基酸序列成熟的IL-10的蛋白(例如缺少分泌的前導(dǎo)序列)在1992年7月20日提交的專利U.S.Patent Application Serial No.07/917,806上已公開的那樣，而這份專利是與International Application No.WO91/00349是相同的；(b)具有和天然IL-10相同的生物學(xué)活性。對于本發(fā)明的目的來說，不管是糖基化的IL-10(例如在真核細胞例如CHO細胞中生產(chǎn)的)還是沒有糖基化的(例如化學(xué)合成的或在大腸桿菌中生產(chǎn)的)都是等效的，而且可以相互替換使用。而且還包括突變蛋白質(zhì)和其它類似物，包括BCRF1蛋白(非洲淋巴細胞病毒病毒性IL-10)，該蛋白也有IL-10的生物學(xué)活性。
適用于本發(fā)明用途的IL-10有不同的來源。例如，可從激活的分泌該蛋白培養(yǎng)基中分離獲得。另外，IL-10或它的活性片段可按本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行化學(xué)合成。請見Mettifield，Science 233341(1986)和Atherton et al.，(Solid Phase)A Practical Approach，1989，I.R.L.Press，Oxford。
獲得該蛋白或多肽的優(yōu)選方案是用分離得到的編碼IL-10多肽的核酸通過重組技術(shù)得到。介紹一般的分子生物學(xué)方法的書有例如Sambrook et al.，(Molecular Cloning)(A Laboratory Maunal)，Cold Spring Harbor，New York，2d ed.，1989，和By Ausbel et al.，(eds)(Current Protocolsin Molecular Biology)，Green/Woley，New York(1987 and periodicsupplements)。正確的序列可用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)從基因組文庫或者cDNA文庫得到。也可使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到。參見，例如(PCR Protocols)(AGuide to Methods and Application)，1990，Innis et al.，(Ed.)Academic Press.New York。
文庫是用從合適的細胞中得到的核酸構(gòu)建的，請見例如在InternationalAppliction Publiction No.WO91/00349中即公開了重組體IL-10的制作方法。有用的基因序列可以查到，例如在各種序列的數(shù)據(jù)庫中例如GenBank.andBMPL or ncleic acid and PIR and Swiss-Prot for protein，c/oIntelligenetics，Mountain View，California，or the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，Wisconsin上述內(nèi)容在此引入做為參考。
包含有編碼人IL-10的序列的克隆已收藏在American Type CultureCollection(ATCC)，Rockville，Martyland，登記號為68191 and 68192號。帶有編碼IL-10序列的其他克隆的鑒定可用核酸雜交法或有對于表達載體所編碼的蛋白可用免疫的方法檢測。根據(jù)公開的Intemational Application Publication No.WO91/00349中所保存的序列所得到的寡核苷酸探針是特別有用的，寡核苷酸探針序列也可從其它物種相關(guān)基因的保守區(qū)中制備。另一選擇，基于IL-10氨基酸序列而得的變性探針也可使用。
可用標(biāo)準(zhǔn)的方法轉(zhuǎn)化原核、哺乳動物、酵母或昆蟲的細胞系，使它們表達大量的該種多肽。對表達和克隆都適用的大腸桿菌代表菌株包括W3110(ATCCBi，27325)，X1776(ATCC No.31244)，X2282 RR1(ATCCMp/31343)，代表的哺乳動物細胞株包括COS-7細胞株，小鼠L細胞和CHP細胞。See Sambrook(1989)and Ausubel et al.，1987 Supplement)。
可用各種表達載體表達編碼IL-10的DNA。在原核或真核細胞中表達重組蛋白的常用載體都可使用。優(yōu)選的載體包括，由Okayama et al.，Mol Cell.Biol.3280(1983)；and Takebe et al.，Mol.Cell.Biol.8466(1988)所描述的PCD各載體。其它以SV40為基礎(chǔ)的載體包括那些已在Kaufmen et al.，Mol.Cell.Biol.21304(1982)and U.S.Patent No.4,675,285中公開的載體這些以SV40為基礎(chǔ)的載體對猴COS-7細胞(ATCCNo.CRL 1651)和其它哺乳動物細胞例如小鼠L細胞特別有用。還請看Douwelset al.，(1989 and Supplements)(Cloning Vectors)(A laboratoryManual)Elsevier，New York。
IL-10可在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的酵母或哺乳動物細胞中以可溶的形式例如以分泌物產(chǎn)品的形式生產(chǎn)。多肽即可按本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法純化。例如純化步驟包括硫酸銨沉淀，離子交換層析，凝膠過濾、電泳、親和層析等。請看，Methods inEnzymology Purificaition Principles and Practiles(Springet-Vertag，NewYork，1982)。
另一種選擇是，IL-10也可以不溶的例如聚合體或包涵體的形式生產(chǎn)。這種形式的IL-10可用本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)步驟進行純化。純化步驟的例子中純化步驟有通過離心將包涵體與已崩解的宿主細胞分離開，然后用促溶劑和還原劑溶解包涵體使多肽形成有生物活性的構(gòu)型。這些步驟的細節(jié)請見例如Winklet et al.，Biochemistry，254041(1986)；Winklet et al.，Bio/Technology 39923(1985)；Kiths et al.，and U.S，.Patent No.4,569,790。
用于轉(zhuǎn)染宿主細胞的核苷酸序列可按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以修飾以使IL-10或其片段具有各種所期望的特性。這類修飾使IL-10與天然產(chǎn)生的序列在一級結(jié)構(gòu)水平上小同例如用氨基酸的插入，替換、缺失和融合。這些修飾方式可結(jié)合使用而獲得最終的經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)鏈。
氨基酸序列的突變體可以按不同的目標(biāo)包括增加血清半衰期，方便純化和制備，增進治療的效果，減輕在治療中的毒副作用的發(fā)生及嚴重程度而進行制備。氨基酸順序的突變體都是自然界中不存在的而是預(yù)先確定的突變體，雖然其它一些突變體可以是翻譯后突變體例如糖基化的突變體或與聚乙二醇(PEQ)結(jié)合的蛋白等等。這些突變體只要它還保留有IL-10的生物學(xué)活性，就可在本發(fā)明中使用。
對編碼多肽的序列的修飾可用各種技術(shù)例如位點導(dǎo)向的突變[Gillman等，Gene 881(1987)]容易地完成。多數(shù)修飾體都要在一個合適的分析體系中對所期望的特征通過常規(guī)的篩選進行評價。例如在International ApplicationPublication No.WO91/00349中即介紹了幾種評價IL-10活性的體外檢測方法。
最好是，治療人類的疾病應(yīng)用人的IL-10，雖然，病毒的IL-10或從其他哺乳類來的IL-10也有可能被使用。更優(yōu)選的方案是使用重組體的人IL-10。人和小鼠IL-10的制備在International Application WO91/00349中已有介紹。非洲淋巴細胞瘤病毒的IL-10(BCRF1蛋白)的克隆和表達已由Moore etal.，在Science 2481230(1990)上公開。重組體人IL-10已成為一種商品可以購買到，例如從Prepro.Tech，Inc.，Rocky Hill，NJ購買。
適于本發(fā)明治療方法的各個體包括任何腫瘤病人都能從激活PBMC細胞溶解活性上，特別是LAK和NK細胞活性激活中獲益。代表性的癌癥患者已有介紹，例如Rosenberg，Supra在專利和(Scientific American)上的文章已作介紹。本發(fā)明的治療方案也適用于預(yù)先處理以使內(nèi)源性IL-4水平升高的個體，這樣以使IL-4阻斷了IL-2對細胞溶解活性的激活。在這類個體中優(yōu)選的治療方案是在使用IL-2之前先用IL-10預(yù)處理。
本發(fā)明中所介紹的用以制備IL-10的標(biāo)準(zhǔn)方法和技術(shù)也可用于制備IL-2和α-IFN，本發(fā)明中使用的IL-2和α-IFN也可從商品途徑得到(例如IL-2可從Cetus，Corporation，Emeryville，CA，α-IFN可從Schenng，Corp.，Keniluorth，NJ獲得)。
除了IL-10和減低水平的IL-2合用再和/或α-IFN一起按此處介紹的方法使用之外，PBMCs(優(yōu)選方案是從要接受治療的病人用標(biāo)準(zhǔn)方法得到)的體外激活以及這些細胞的使用基本上按上面提到的Rosenberg的文獻進行。所使用的激活的PBMCs的數(shù)量范圍為106～1012個。盡管不是必需的，但優(yōu)選的實施方案是如同這里所述的IL-10與這樣激活的細胞一起使用或后續(xù)使用。
在一種實施方案中是先用IL-10預(yù)處理激活PBMCs[例如在4ng/ml(100單位/ml)或40ng/ml人IL-10的存在下在37℃培養(yǎng)大約3天]，然后，洗滌細胞去除游離的IL-10再加入低濃度的IL-2(典型的是約2units/m)。
這里所用的由1L-10單獨或與其他細胞因子一起使用以激活細胞溶解細胞的優(yōu)選使用方案是用靜脈注射。這個也可以用如下方法實行，例如通過中心靜脈導(dǎo)管進入大的外周靜脈或由經(jīng)皮的導(dǎo)管進入肝動脈。
IL-10通常以藥劑組合物的形式使用，該組合物包括藥劑載體和單用的有效劑量的IL-10或者是IL-10與IL-2和/或α-IFN一起合用。藥劑載體可以是適于將藥劑傳輸給患者的任何可配伍的非毒性物質(zhì)，對這類藥物的不經(jīng)過消化道使用途徑的有用組合物已有很深的了解，例子參見Remingtons PhermaceuticalScience 15th Ed.(Mack Publishing Company Easton，PA，1980)。另外，本發(fā)明的組合物可通過植入的或注射的藥物傳輸系統(tǒng)進入患者體內(nèi)。例如，Urquhert et al.，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.2499(1984)；Leuis(Ed.)(Controlled Release of Pesticides and Pharmeceuticals)(PlenumPress，NJ.1981)U.S.Patent No.3,270,960；等等。
細胞因子的使用可通過任何熟知的使用途徑，包括靜脈、腹膜及皮下給藥。靜脈給藥是最優(yōu)選的使用途徑。
當(dāng)通過非消化道方式給藥時，組合物都結(jié)合藥劑載體做成統(tǒng)一的單位劑量的可注射形式(溶液、懸液、乳液)。這類載體的例子有生理鹽水，Ringer’s液，葡萄糖液和Hank’s液。非水相的載體可用非揮發(fā)油和油酸乙酯。優(yōu)選載體是5％葡萄糖/鹽溶液。載體可包含一些少量的添加物以增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性例如緩沖劑和防腐劑等。IL-10的優(yōu)選的統(tǒng)一形式是基本上不含聚合體和其它蛋白的純的形式，濃度約為5-20μg/ml。
本發(fā)明的組合物也可用標(biāo)準(zhǔn)的基因治療技術(shù)傳輸而導(dǎo)入患者體內(nèi)，包括如直接的DNA組織注射，使用重組病毒載體以及轉(zhuǎn)染細胞的植入，見例如，Rosenberg，J.Clin.Oncol.10180(1992)。
此處所介紹的一種或多種治療藥劑的合用可以同時使用(與IL-10一起使用)或者可以順序使用。優(yōu)選方案是IL-10先于IL-2使用。α-IFN可以與IL-10和/或IL-2一起或后續(xù)使用。所有的藥劑在患者體內(nèi)有足夠的濃度以使在治療上有效而使腫瘤消退。
這里所用的“有效劑量”術(shù)語的含義指IL-10的量足以減少或阻止繼承性免疫療法中的副作用，同時又能提高LAK和NK細胞的細胞溶解活性。對一個特殊的患者來說所需的細胞因子的有效劑量可根據(jù)象被治療的腫瘤的類型和狀態(tài)，患者的整體健康狀況、所用的治療方法、副作用的嚴重程度以及同時正在使用的其它藥物的量和種類等一類因素而不同。
“足以增加LAK細胞的活性”的細胞因子的量這里的定義指用Daudi細胞為細胞溶解評價體系，需要的細胞量所產(chǎn)生的細胞溶解活性至少比IL-10單獨使用時可增加25％，優(yōu)選方案是增加到至少50％，最優(yōu)選方案是增加到至少約100％。
優(yōu)選方案是IL-10給藥用它最大的極限用量，從10～108單位每天每公斤體重。同樣地IL-2和α-IFN給藥也可使用最大極限用量(例如對IL-2靜脈給藥所用量為每8小時105單位每公斤體重，用50ml 0.4％生理鹽水和5％白蛋白作為載體；α-IFN的劑量為靜脈給藥每8小時106U每公斤體重，用0.9％生理鹽水加5％白蛋白作為載體)。前面已說過，所用劑量是由臨床醫(yī)師根據(jù)每個患者個體所能承受的最大極限而作下降調(diào)整。
本發(fā)明的方法也可與傳統(tǒng)的治療癌癥的方法一起使用，例如放療和化療使用傳統(tǒng)的化療藥物象長春堿、鉑類化合物及5-氟尿嘧啶的化療。
單獨使用IL-10或與其它細胞因子合用處理人外周血單核細胞引發(fā)對人腫瘤靶細胞的細胞溶解活性增強。因為免疫治療的效率在很大程度上依賴于腫瘤的負擔(dān)程度，所以在大塊的主要腫瘤塊被切除之后使用這里所述的治療方法將會特別有益。通常在手術(shù)位點發(fā)生的炎癥反應(yīng)也許會對治療效果有好處。
實施例下面的非限定性實例將用于本發(fā)明的說明。
IL-10對人外周血單核細胞細胞溶解活性的影響研究了IL-10對人外周血單核細胞體外細胞溶解活性的影響。結(jié)果概述如下I.IL-10刺激人外周血單核細胞中淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)和自然殺傷細胞(NK)的活性。大鼠抗IL-10單克隆抗體可中和IL-10驅(qū)動的細胞溶解活性。
2.來源于CHO和大腸桿菌表達系統(tǒng)的IL-10在刺激LAK和NK細胞活性中表現(xiàn)出相同的濃度反應(yīng)模式，因此在生物學(xué)意義上是等效的。
3.PBMCs用IL-10和低劑量IL-2處理所表現(xiàn)出的LAK細胞活性比任何一種細胞因子單獨使時的活性都強。
4.PBMCs用IL-10預(yù)處理2天后再加入IL-2細胞的溶解活性增加。
5.IL-4抑制IL-2誘導(dǎo)的LAK細胞活性，而IL-10拮抗這種抑制作用。
6.IL-10加上IL-2在低的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比的情況下產(chǎn)生增加的LAK細胞對細胞的溶解活性。
除了對PBMCs所觀察到的影響之外還發(fā)現(xiàn)在有IL-10的條件下培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞對外源因子(即γ-IFN和TFN-α)的應(yīng)答不受影響，而在含有IL-2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞卻由于IL-2的毒性而不起反應(yīng)。
材料與方法重組的人細胞因子和抗IL-10的抗體重組的人IL-10是用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)的(來自大腸桿菌和CHO二者)。用MC-9細胞的增殖檢測用標(biāo)準(zhǔn)方法純化后產(chǎn)品的比活性分別是4.1×107E.coli和2.1×107(CHO)Units/mg[Thompson-Sripes et al.，J.Exp.Med.173507(1991)]，如是按定義為大約4ng基本上純一的IL-10約含有100單位的生物學(xué)活性。
從Palo Alto.CA DNAX分子生物學(xué)研究所John Abrams博士處得到一個定名為19F1的大鼠抗人IL-10的單克隆抗體。
人外周血單核細胞的分離(PBMCs)
外周血是用肝素或EDTA作為抗凝劑用靜脈穿刺術(shù)從健康的成人供體得到的。PBMCs是用二步法分離的，包括葡聚糖沉淀和按著在FICOLL PAQUE”上以1250rpm(轉(zhuǎn)/分)離心30分鐘。收集主要包括淋巴細胞和單核細胞的界面帶，并用含10％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)清洗至少二次(JRHBiosciences)。
細胞毒性檢測Daudi(對LAK敏感)和K562(對NK敏感)靶細胞分別從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Tissue Collection)分別以登記號(underaccession Nos.)CCL 213和CCL 243得到。用Spits等所介紹[J.Immunol14129(1989)]方法把Daudi和K562細胞標(biāo)記以51Cr。PBMCs經(jīng)過培養(yǎng)之后，進行收集，洗二次，即可在一個51Cr釋放檢測體系中作為效應(yīng)子細胞(Spits etal.，Supra)。用5×10351Cr標(biāo)記的靶細胞與不同量的效應(yīng)子細胞(E/T＝20∶1，5∶1，2∶1)以100μl體積在V型底的96孔板中混合。96孔板以1000rpm離心5分鐘后在飽和濕度5％的CO2氣中培養(yǎng)4小時，培養(yǎng)4小時后用500xg離心5分鐘。上清用SKATRON(Skatron Instruments)收集器收集，并用γ計數(shù)器(LKB-Pharmacia)計數(shù)。用51Cr標(biāo)記的靶細胞與1％SDS通過孵育來測定總的溶胞作用。數(shù)據(jù)代表三次測定的平均值。
溶胞作用的百分比按下式計算 人PBMCs與細胞因子孵育a.IL-10單獨孵育除非有特別說明，上述所分離的PBMCs以每毫升1×106細胞的濃度在補加有IL-10或人的IL-10(CHO)含有10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中37℃培育3天。按上所述確定細胞溶解活性。
b.用IL-10和IL-2同時孵育把PBMCs用4ng/ml的IL-10與或不與IL-2(Genzyme)(2或20U/ml)一起在37℃孵育3天。
c.用IL-10和IL-2的順序培育把PBMCs用4ng/ml的IL-10在完全培養(yǎng)基中孵育2天。加入IL-2使最終濃度為2U/ml或20U/ml。培養(yǎng)過夜后，測定LAK和NK細胞的細胞溶解活性。
抗IL-10的單克隆抗體對IL-10激活LAK和NK細胞的影響在2μg/ml的抗IL-10單克隆抗體(19F1)或同型對照(大鼠IgG2a)存在的條件下，把PBMCs與40ng/ml IL-10孵育3天。
IL-10對人外周血單核細胞中淋巴因子激活的殺傷細胞和自然殺傷細胞細胞溶解活性的影響根據(jù)所用的腫瘤靶細胞從操作上即可區(qū)分LAK和NK細胞的細胞溶解活性。來源于Burkitt’s淋巴瘤的Daudi細胞是經(jīng)典的檢測激活的LAK細胞細胞溶解活性的靶細胞。來源于人紅白血病K562細胞株的細胞被用做檢測NK細胞細胞溶解活性的特異靶細胞。在這些實驗中把人的PBMCs用不同濃度的IL-10處理3天再用上面介紹的標(biāo)準(zhǔn)的51Cr的釋放測定法確定細胞溶解活性。
LAK的活性結(jié)果如表1所示，其中標(biāo)準(zhǔn)差在平均值下面給出。
表1IL-10對淋巴因子激活的PBMCs的激發(fā)作用(用溶胞作用的％表示a)IL-10濃度(ng/ml)b供體 0 0.040.4 4 40 1001 0 4.2518.344 26.2 67.52 0 5.5 7.2 10 31.5 27.63 1817.729.239.1 29.7 55.14 0 8.8 10.222.2 35.8 35.95 4.6 8.1 15.620.6 20.1 12.16 14.6 19.740.754.4 42.9 43.4平均值 6.2 10.620.2c31.7c31.0c40.2c±3.3 ±2.6 ±5.1 ±6.8 ±3.2 ±8.0a.51Cr標(biāo)記的Daudi靶細胞的溶胞作用百分比是在20∶1的效應(yīng)子細胞靶細胞比和用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放測定法得到的。數(shù)據(jù)代表三次測定的平均值。
b.在測定細胞溶解活性之前，把從正常供體得到的人PBMCs先用IL-10處理3天。
c.用Student’s-t檢驗確定，IL-10處理組和培養(yǎng)基對照組間有顯著性差異，P≤0.05。
表1的資料顯示IL-10對從6個人供體中得到的PBMCs中LAK活性的影響。盡管6個供體之間差異顯著，但在所有6個供體中IL-10誘發(fā)的細胞溶解能力的增加都表現(xiàn)出對IL-10的濃度依賴。統(tǒng)計學(xué)活性顯著的IL-10的濃度是0.4ng/ml或更大(P≤0.05)。而且還觀察到供體PBMCs顯示了一個細胞溶解活性的基礎(chǔ)水準(zhǔn)(即在無細胞因子條件中)，在所有測定過的效應(yīng)子細胞與靶細胞比中5％或更少的細胞溶解活性對IL-10反應(yīng)最靈敏(資料未附上)
對其它腫瘤靶細胞，包括人腎細胞瘤株，兩個不同的人黑色素瘤株和人結(jié)腸癌細胞株也得到類似的結(jié)果。Rosenberg也曾用過人腎細胞瘤和黑色素瘤細胞，而且還對帶有這樣腫瘤的病人用IL-2做過體內(nèi)的繼承性免疫治療。在所有的實驗中，靶細胞的溶細胞作用百分比都依賴IL-10濃度。
在另外的一些實驗中發(fā)現(xiàn)IL-10單用或與IL-2合用也可引發(fā)增加對U937(人組織細胞瘤)；SW620(人結(jié)腸癌)和SKBR3細胞(人乳腺癌)的細胞溶解活性。在用HS294T細胞(人黑色素瘤)做靶細胞時的實驗中IL-10在所測試過的劑量中不表現(xiàn)引發(fā)反應(yīng)。
基礎(chǔ)水平的NK的細胞溶解活性(即在不含細胞因子的條件下對K562靶細胞的溶胞作用有比LAK細胞基礎(chǔ)水平的溶胞活性要高的趨勢。NK的活性可用細胞因子如IL-2進一步增強[Perussia，Supra；Philips and Lanier J.Exp.Med164814(1986)]。
在測定LAK細胞活性的平行實驗中，用上述6個相同的供體測定了IL-10對PBMCs中NK細胞活性的影響。結(jié)果如表2所示，其中標(biāo)準(zhǔn)差在平均值下面給出。
表2IL-10對PBMCs中NK活性的激發(fā)(以溶胞作用的％表示a)IL-10的濃度(ng/ml)b供體 0 0.04 0.4 4 40 1001 22.2 30.6 25.257.2 51.549.72 20.4 24.7 31.356.7 65.671.53 61.4 55.6 37.981.1 80.081.54 13.8 25.2 23.237.5 52.254.25 13.0 19.9 20.225.1 23.520.36 15.9 25.3 45.466.6 43.756.1平均值 24.4 30.2 30.554.0c52.75c55.5c±7.5±5.2 ±3.9 ±8.2 ±7.8 ±8.5a.51Cr標(biāo)記的Daudi靶細胞的溶胞作用百分比是在效應(yīng)子細胞與靶細胞比為20∶1的條件下用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放測定法得到。數(shù)據(jù)是三次實驗的平均值。
b.從正常供體來源的人PBMCs在測定細胞溶解活性之前先用IL-10處理3天。
c.用Student’s-t檢驗確定IL-10處理組和培養(yǎng)基對照組間有顯著性差異，P≤0.05。
從表2可明顯看到IL-10誘導(dǎo)從供體來源的PBMCs中NK細胞介導(dǎo)的細胞毒作用的增強有顯著的劑量依賴性。IL-10的濃度為4ng/ml或更高時的溶胞作用在統(tǒng)計學(xué)上明顯增加。如同在LAK活性測定中一樣，IL-10對NK細胞活性的影響依供體不同而有差異。
IL-2與IL-10對內(nèi)皮細胞的影響的比較設(shè)計了在IL-10存在下測定內(nèi)皮細胞單細胞層的存活能力的實驗。內(nèi)皮細胞在IL-10存在條件下培養(yǎng)時對外源細胞因子(γ-IFN和TFN-α)的應(yīng)答沒有減弱，而平行實驗以相同單位劑量的IL-2用培育相同的時間由于IL-2的毒性而使細胞對外源細胞因子的應(yīng)答能力喪失。
抗IL-10的單克隆抗體對IL-10激活LAK和NK細胞作用的影響如表3和表4所示表示的平均值帶有標(biāo)準(zhǔn)差，在2μg/ml IL-10的單克隆抗體19F1存在下，分別地用40ng/ml的IL-10對LAK和NK細胞的細胞溶解活性的激活減少3倍(P≤0.05)。用2μg/ml的大鼠IgG2a同型對照抗體代替抗IL-10的單克隆抗體所產(chǎn)生細胞的溶解活性水平所得的結(jié)果與那些單獨用40ng/ml IL-10所得結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上是不能得出區(qū)別的。
表3抗IL-10的單克隆抗體對IL-10誘導(dǎo)的淋巴因子激活的殺傷細胞的細胞溶解活性的抑制(以溶胞作用％表示)a培養(yǎng)條件b供體 培養(yǎng)基 40ng/ml IL-10 IL-10IL-10+19F1 +IgG2a1 5.6 23.5 15.7 28.22 4.7 21.3 11.0 17.53 5.4 42.5 0.0 35.84 2.1 42.0 12.8 26.55 4.7 19.1 0.0 11.65平均值 4.5±0.629.6±5.3 7.9c±3.3 23.9±4.3a.51Cr標(biāo)記的Daudi靶細胞的溶胞作用百分比是在20∶1效應(yīng)子細胞∶靶細胞比和用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放法測定的。數(shù)據(jù)是三次測定的平均值。
b.從正常供體得到的人外周血單核細胞在測細胞溶解活性之前先在2mg/ml19F1(抗人IL-10)或大鼠IgG2a(同型對照)存在的條件下用40ng/ml IL-10處理3天。
c.用Student’s-t檢驗IL-10單獨處理和在抗IL-10單克隆抗體存在處理之間結(jié)果有顯著性差異，P≤0.05。
表4抗IL-10單克隆抗體對IL-10誘導(dǎo)的自然殺傷細胞活性的中和作用(以溶胞作用％表示a)培養(yǎng)條件b供體 培養(yǎng)基40ng/ml IL-10 IL-10IL-10 +19F1 +IgG2a1 21.1 38.320.6 27.22 28.0 71.022.2 53.23 22.2 51.5 0.0 70.54 18.0 25.412.3 20.85 23.2 53.254.5 84.9平均值22.5±1.6 47.9±7.6 19.1c±6.6 51.3±12.7a.[51Cr]標(biāo)記的Daudi靶細胞溶胞作用百分比是在20∶1效應(yīng)子細胞∶靶細胞比和用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放法測定的。數(shù)據(jù)是三次測定的平均值。
b.從正常供體得到的人外周血單核細胞在測細胞溶解活性之前先在2mg/ml19F1(抗人IL-10)或大鼠IgG2a(同型對照)存在的條件下用40ng/ml IL-10處理3天。
c.用Student’s-t檢驗IL-10單獨處理和在抗IL-10單克隆抗體存在處理之間結(jié)果有顯著性差異，P≤0.05。
IL-10和其它細胞因子合用所誘導(dǎo)的細胞溶解活性a.IL-10和IL-2同時孵育人PBMCs在5∶1的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比和IL-10存在下用次極限激活濃度的IL-2(2或20U/ml)孵育，結(jié)果如表5所示，平均值下是標(biāo)準(zhǔn)差。
表5在人外周血單核細胞中用IL-10和IL-2同時孵育所誘導(dǎo)的淋巴因子激活的細胞溶解活性(以溶胞作用％表示a)培養(yǎng)條件b供體 培養(yǎng)基 2U IL-2 4ng IL-10IL-10 20U IL-2+IL-210.0 3.3 3.715.9 24.622.6 7.6 3.823.5 41.036.1 5.0 13.317.7 11.443.350.1 51.668.7 80.052.4 9.4 12.829.3 45.769.928.9 16.038.8 67.1平均值 4.117.4 16.832.3 44.9c±1.42 ±7.6 ±7.2 ±7.2 ±10.4a.[51Cr]標(biāo)記的Daudi靶細胞的溶胞作用百分比是在5∶1的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比和用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放法測定的。數(shù)據(jù)是三次測定的平均值。
b.把從正常供體來源的人外周血單核細胞在測細胞溶解活性之前先用4ng/mlIL-10和2U/ml IL-2處理3天。
c.用Student’s-t檢驗測定供體PBMCs用IL-10和IL-2處理與用20U/mlIL-2單處理比較，細胞溶解活性之間無顯著性差異，P≤0.05。
如表5所示，2U/ml和4ng/ml IL-10合用使LAK活性(效應(yīng)子細胞∶靶細胞＝5∶1)有額外的增加。這種活性水平比二種中任一種細胞因子單用時的活性都顯著增高。達到了10倍高的IL-2濃度所產(chǎn)生的活性水平。用Studeat’s-t檢驗測得結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的，P≤0.05。
b.IL-10和α-IFN同時孵育用PBMCs IL-10和α-IFN共同孵育對Daudi細胞的細胞溶解活性表現(xiàn)為相似的額外的增加，但對NK靶細胞卻不是。結(jié)果如表6所示，標(biāo)準(zhǔn)差在平均值下面給出。
表6在人外周血單核細胞中用IL-10和α-IFN合用對淋巴因子激活的殺傷細胞活性的誘導(dǎo)(以溶胞作用％表示a)培養(yǎng)條件b供體 培養(yǎng)基 α-IFN IL-10 IL-10+α-IFN14.4 7.917.835.721.011.715.432.031.612.3 5.526.4平均值 2.310.612.631.4±1.0 ±1.4±3.8 ±2.7a.[51Cr]標(biāo)記的Daudi靶細胞的溶胞作用百分比是在10∶1的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比和用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放法測定的。數(shù)據(jù)是三次測定的平均值。
b.從正常供體制備的人外周血單核細胞在測定細胞溶解活性之前先用4ng/mlIL-10和100U/ml α-IFN處理3天。
c.用Student’s-t檢驗測知，IL-10和α-IFN合用與IL-10或α-IFN單獨使用比較誘導(dǎo)供體PBMCs的細胞溶解活性上所觀察到的不同在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的，P＜0.05。
相反，IL-10與IL-4、IL-5、GMCSF或γ-IFN一起使用都不比IL-10單獨使用更有效(結(jié)果未列出)。
IL-10和IL-2的順序孵育按上面介紹的方法，將PBMCs保持在培養(yǎng)基或加有IL-10的培養(yǎng)基中。兩天后加入IL-2，使其終濃度為2或20U/ml。在再一次過夜培養(yǎng)后測定對Daudi細胞的細胞毒害活性。從5個供體綜合的結(jié)果如表7所示，其中標(biāo)準(zhǔn)差在平均值的下面給出。
表7在人外周血單核細胞中用IL-10預(yù)處理接著用IL-2處理對淋巴因子激活的細胞溶解活性的誘導(dǎo)(以溶胞作用％表示a)預(yù)培養(yǎng)條件b供體培養(yǎng)基IL-10cIL-2dIL-10+IL-2e129.7 21.1 44.8 1162 5.5 18.3 12.2 20.7314.7 58.1 74.5 100426.2 59.5 54.3 81.95 4.8 28.2 22.5 40.6平均值 16.2 37.0 41.7 71.8±5.1 ±9.0 ±11.4 ±17.9a.[51Cr]標(biāo)記的Daudi靶細胞的溶胞作用的百分比是在5∶1的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比和用標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放法測定的。數(shù)據(jù)是三次測定的平均值。
b.從正常供體制備的人外周血單核細胞在加入2U/ml IL-2之前先在加有4ng/ml IL-10的培養(yǎng)基中保持2天。在再過夜培養(yǎng)后測定細胞溶解活性。
c.供體PBMCs用IL-10孵育3天。
d.供體PBMCs在加入IL-2前是單獨培養(yǎng)在培養(yǎng)基中的。
e.供體PBMCs在加入20U IL-2之前先用IL-10孵育2天。
如表7所示，供體PBMCs在加入IL-2之前先用IL-10預(yù)處理的實驗組所觀察到的細胞溶解活性(71.8±17.9％)比在加入IL-2之前只將供體PBMCs培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中的實驗組的細胞溶解活性(41.7±11.4)增加了約2倍。在用IL-10預(yù)處理和那些不用IL-10預(yù)處理的樣本間所觀察到差異在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的P≤0.14。
在用IL-10接著用α-IFN順序孵育中見到有類似的細胞溶解活性增加的模式(資料未出示)。
IL-10和IL-4對IL-2誘導(dǎo)的細胞毒作用的阻斷把從6個人類供體得到的PBMCs培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基分別含有單有20U/ml的IL-2，20U/ml的IL-2加1000U/ml的IL-4，20U/ml IL-2加1000U/ml IL-4加4ng/ml IL-10。結(jié)果如表8所示，標(biāo)準(zhǔn)差在平均值的下面給出。表8IL-10對人外周血單核細胞中IL-4對IL-2誘導(dǎo)的淋巴因子激活的細胞溶解活性的阻斷的拮抗作用(以溶胞作用％表示a)供體 培養(yǎng)基 IL-2bIL-2c+IL-2d+IL-4 IL-4+IL-10112.727.6 35.045.72 5.426.3 17.533.73 1.725.1 14.136.04 3.829.6 14.122.15 3.347.1 17.163.86 6.649.5 20.640.8平均值 5.534.2 19.740.3±1.6 ±4.5 ±3.2 ±5.7a.對[51Cr]標(biāo)記的Daudi靶細胞溶胞作用百分比是在20∶1的效應(yīng)子細胞∶靶細胞比和以標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放法測定的。數(shù)據(jù)是三次測定的平均值。
b.從正常供體分離到的人外周血單核細胞用20U/ml IL-2處理3天。
c.供體PBMCs用20U/ml IL-2和100U/ml人IL-4處理3天。
d.供體PBMCs用20U/ml IL-2，1000U/ml人IL-4和4ng/ml IL-10處理。
如表8中的數(shù)據(jù)表明單獨用20U/ml IL-2處理，LAK敏感的靶細胞的溶胞作用比例約34.2％。當(dāng)孵育開始時即加入1000U/ml的IL-4時，溶胞作用能力被抑制了大約2倍。但如果在最初培養(yǎng)的24小時加入4ng/ml的IL-10，IL-4的抑制作用就沒有了。
IL-2單用和所有三種細胞因子一起使用的結(jié)果無顯著性差異(Student’s-t檢驗，P≤0.05)，說明IL-10對IL-4阻斷作用的拮抗是基本上完全的。
只要不違背本發(fā)明的精神實質(zhì)和范圍，本發(fā)明可做各種修改和變動，這一點對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。這兒所介紹的具體實施方案只是以舉例的形式給出的，而本發(fā)明也只是受后面所附的權(quán)利要求條款所限制。
權(quán)利要求
1.一種治療癌癥的方法，包括給癌癥患者施用有效量的IL-10激活的PBMCs以使該癌癥消退。
2.權(quán)利要求1的方法，進一步包括同時或順序?qū)λf的個體施用有效量的IL-10。
3.治療癌癥的藥劑組合物的生產(chǎn)方法，包括將IL-10激活的PBMCs與藥理學(xué)上可接受的載體混合。
4.權(quán)利要求1到3之任一方法，其中IL-10的施用是與(a)足夠量的能增強LAK細胞活性但又不引起毒副作用的IL-2和/或(b)足夠量的能增加LAK細胞激活活性的α-IFN合用的。
5.治療癌癥的藥劑組合物，包括IL-10激活的PBMCs和藥理上可接受的載體。
6.權(quán)利要求5的藥劑組合物，進一步包括IL-10單用或與IL-2和/或α-IFN合用。
7.IL-10激活的PBMCs在治療癌癥方面的應(yīng)用。
8.IL-10激活的PBMCs在制造治療癌癥的藥劑方面的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7或8的應(yīng)用，其中IL-10激活的PBMCs和單獨的IL-10一起使用或者與IL-10、IL-2和/或α-IFN一起使用。
10.一種拮抗內(nèi)源性IL-4對IL-2誘導(dǎo)的細胞毒作用的阻斷作用的方法，包括對有這類治療需求的患者施用有效量的IL-10。
11.IL-10在制造拮抗IL-4對IL-2誘導(dǎo)的細胞毒作用的阻斷作用的藥劑方面的應(yīng)用。
12.權(quán)利要求1至11之任一項的方法、藥物組合物或應(yīng)用，其中的IL-10是人IL-10。
全文摘要
本發(fā)明涉及IL-10的使用，單獨用或與IL-2和/或α-IFN合用，激發(fā)外周血單核細胞的細胞溶解活性以治療癌癥。
文檔編號A61K38/21GK1142186SQ94194863
公開日1997年2月5日 申請日期1994年1月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月20日
發(fā)明者M·A·許瓦茲 申請人:先靈公司