專(zhuān)利名稱(chēng)：人αB-晶體蛋白在制備保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，特別是涉及到一種人α B-晶體蛋白在制備保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用及藥物。
背景技術(shù)：
視神經(jīng)損傷是臨床常見(jiàn)眼外傷類(lèi)型和致盲原因。近年，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，交通事故等外傷的增多，視神經(jīng)損傷也明顯增多，在顱腦外傷患者中其發(fā)生率為6% 12.6%。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為視神經(jīng)損傷后發(fā)生不可逆的病理改變，神經(jīng)組織不能再生，視功能損傷不能恢復(fù)。目前，尚無(wú)確切有效的治療手段。因此在視神經(jīng)損傷后，及時(shí)采取有效的治療方法，保護(hù)和挽救視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells, RGCs)的存活和促進(jìn)其軸突修復(fù)， 已成為目前研究的熱點(diǎn)。視神經(jīng)損傷后難以再生的主要原因有損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cellsRGCs)的繼發(fā)性凋亡；失去靶細(xì)胞提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；損傷局部膠質(zhì)瘢痕的形成以及抑制性微環(huán)境的阻礙作用。為此，以往促進(jìn)視神經(jīng)再生研究主要集中在1)補(bǔ)充外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。雖可一定程度保護(hù)RGCs存活，但作用短暫，多無(wú)促再生作用；2)干擾凋亡信號(hào)通路可減少RGCs發(fā)生凋亡，但并不能增強(qiáng)其軸突再生能力；3)用抗體或核酸干擾阻斷髓鞘抑制物的作用能促進(jìn)RGCs軸突再生，但也只是短距離再生。此外，外周神經(jīng)移植可促進(jìn)視神經(jīng)再生，但未能實(shí)現(xiàn)再生纖維與視中樞形成功能聯(lián)接。由此可見(jiàn)，目前的各種方法均不能達(dá)到神經(jīng)纖維長(zhǎng)距離有效的功能性再生。α B-晶體蛋白是α -晶體蛋白的一個(gè)亞基，Srivastava于2002年首次從晶 ^^1 ^(Srivastava OP, Srivastava K. Existence of deamidated
alphaB-crystal1 in fragm ents innormal and cataractous human lenses[J]. Mol Vis. 2003,9 :110-118.)。α B-晶體蛋白是小分子熱休克蛋白家族中的sHspB5，因此其具有小分子熱休克蛋白家族的共性，分子量小，大小約20KD，參與細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程，并抵御多種因素引起的應(yīng)激損傷和凋亡。不僅可以對(duì)變性神經(jīng)組織有保護(hù)和促進(jìn)修復(fù)作用， 還具有抑制炎癥、應(yīng)激反應(yīng)，維護(hù)細(xì)胞骨架蛋白和骨架網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性，及抵抗缺氧、高溫、反射線及藥物等因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的作用。國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果也顯示，αΒ-晶體蛋白與眼科青光眼視神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜撕裂、年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷， 視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良、糖尿病視網(wǎng)膜病變等多種病變有關(guān)。而且，重組αΒ-晶體蛋白用于多發(fā)性硬化的治療，已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了良好的治療效果(Ousman SS, Tomooka BH, vanNoort JM et al. Protective and therapeutic role for alphaB-crystal1 in in autoimmunedemyelination[J], Nature. 2007,448(7152) :474-479)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)既不在玻璃體腔注射神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，也不需髓鞘抑制物的中和抗體，晶狀體損傷后能顯著促進(jìn) RGCs的存活及軸突再生，并且再生軸突可達(dá)到上丘，形成功能性突觸聯(lián)系，這一保護(hù)作用顯著強(qiáng)于已知神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及中和髓鞘抑制物的作用，但尚不明確這種保護(hù)作用的機(jī)理及起保護(hù)作用的活性物質(zhì)是什么。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的空白，提供一種保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物。人α B-晶體蛋白在制備保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。所述保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物，其特征在于其有效成分為分離純化的重組人α B-晶體蛋白，所述重組人α B-晶體蛋白的氨基酸序列如kq ID No. 1所示。所述藥物的劑型為注射劑。所述藥物的制備方法將分離純化的重組人α B-晶體蛋白溶于不影響α Β_晶體蛋白活性且適用于人體注射的溶劑中。所述溶劑的配方為20mM Tris-HCl, pH 7. 5，50mM氯化鈉，ImM EDTA，溶于無(wú)菌水中。所述重組人α B"晶體蛋白是人工構(gòu)建的包含有如kq ID No. 2所示的核苷酸序列的重組表達(dá)載體在體外表達(dá)，然后經(jīng)分離純化而得的重組蛋白。所述體外表達(dá)指將所述重組表達(dá)載體pET28a_a B-crystallin轉(zhuǎn)染到BL21細(xì)胞中，誘導(dǎo)陽(yáng)性BL21細(xì)胞表達(dá)重組人aB-晶體蛋白。本發(fā)明基于發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)人源a B晶體蛋白是晶體源性神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)并能與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞膜結(jié)合，而且能拮抗髓鞘抑制物的阻礙作用促進(jìn)RGCs突起的生長(zhǎng)。發(fā)明人通過(guò)一序列動(dòng)物模型試驗(yàn)證明重組人a B-晶體蛋白在視神經(jīng)損傷后對(duì)RCGs有明顯的保護(hù)作用，能夠明顯提高RGCs的存活率，促進(jìn)RGCs突起的生長(zhǎng)和受損的視神經(jīng)軸突再生。根據(jù)這一系列試驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明提出了重組人a B晶體蛋白在制備保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。這類(lèi)藥物以人工表達(dá)的重組人aB晶體蛋白為有效成分，能夠?qū)σ暰W(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的損傷提供有效的保護(hù)和恢復(fù)作用，促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞突起的生長(zhǎng)和軸突再生。本發(fā)明的藥物，主要制備成注射劑，經(jīng)靜脈給藥，注射劑的溶劑須是不影響a B-晶體蛋白活性，并適合人體注射兩個(gè)條件。人aB-晶體蛋白為已知蛋白，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于對(duì)a B-晶體蛋白活性及保存條件的了解，可配制多種溶劑對(duì)有效成分重組人 a B-晶體蛋白進(jìn)行溶解制備成本發(fā)明的藥物注射劑。本發(fā)明還提供了藥物的制備方法，主要步驟是體外制備重組人a B-晶體蛋白，然后溶于溶劑中。體外制備重組人aB-晶體蛋白，包括構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染體外宿主細(xì)胞，培育細(xì)胞使其表達(dá)重組蛋白等步驟，aB-晶體蛋白可依照現(xiàn)有技術(shù) (Ousman SS, Tomooka BH, vanNoort JM et al. Protective and therapeutic role for alphaB-crystallin in autoimmunedemyelination[J]. Nature. 2007,448(7152) 474-479)來(lái)操作。


圖1-1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，1 泳道DL2000DNA marker, 2 泳道PCR 產(chǎn)物圖 1-2 PMD19-T-α B-crystallin 酶切鑒定電泳圖，1 泳道:DNA ladder marker, 2 泳道:PMD 19_Τ_ α B-crystallin 酶切條帶
圖 1-3 pET32a- α B-crystal 1 in 酶切鑒定電泳圖，1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道pET32a_ α B-crystalIin 酶切條帶圖1-6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道PCR 產(chǎn)物圖 1-7 pET28a- α B-crystal 1 in 酶切鑒定電泳圖1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道pEI^8a_ α B-crystalIin 酶切條帶圖 1-8 pET28a- α B-crystal Iin 質(zhì)粒測(cè)序圖1-9重組蛋白SDS-PAGE分析1泳道蛋白分子量marker2-4泳道0. 4mM和0. 6mM濃度的IPTG下誘導(dǎo)的上清和沉淀圖1-10 (a)重組α B-晶體蛋白Q柱純化1-10 (b)層析過(guò)程中的α B-晶體蛋白SDS-PAGE1-3泳道上樣樣品、穿透、沉淀，4泳道蛋白分子量marker，5-9泳道純化過(guò)程中pl、p2、p3、p4、p5分別收集的純化蛋白圖1-11重組蛋白考馬斯亮藍(lán)染色1泳道蛋白分子量marker2泳道重組人aB-晶體蛋白；圖1-13重組人α Β_晶體蛋白肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜鑒定蛋白評(píng)分圖1-14重組人α Β_晶體蛋白肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜鑒定結(jié)果圖2-1實(shí)驗(yàn)用Long Evans大鼠圖2-2實(shí)驗(yàn)用中號(hào)無(wú)創(chuàng)血管鉗圖2-3大鼠尾靜脈注射圖2-4大鼠上丘和外側(cè)膝狀體定位圖2-5大鼠視網(wǎng)膜鋪片RGCs計(jì)數(shù)示意2-7正常組大鼠視網(wǎng)膜熒光金逆行標(biāo)記的RGCs熒光金標(biāo)記的正常RGCs細(xì)胞形態(tài)呈三角形(b圖粗箭頭)或圓形(b圖細(xì)箭頭)， 胞漿熒光均勻明亮。&(\100倍)，13(\400倍)圖2-8視神經(jīng)損傷后2周，各組視網(wǎng)膜熒光金標(biāo)記的RGCsa(l) :C 組(X200 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X200 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)圖2-9視神經(jīng)損傷后4周，各組視網(wǎng)膜熒光金標(biāo)記的RGCsa(l) :C 組(X200 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X200 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)
圖2-11正常大鼠β -IΙΙ-tubulin免疫熒光染色a(X200 倍)，b(X400 倍)圖2-12視神經(jīng)鉗夾傷2周后，大鼠β -ΙΙΙ-tubulin免疫熒光染色a(l) :C 組(X 100 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X 100 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)圖2-13視神經(jīng)損傷后4周，各組β ΙΙΙ-tubulin免疫熒光染色的RGCs
a(l) :C 組(X200 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X200 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.人α B-晶體蛋白的制備一、質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞1.大腸桿菌 BL21(DE3)2. PMD19-T 載體(TAKARA 公司，日本)3. DH5 α 菌株、pET32a 質(zhì)粒、pET28a 質(zhì)粒(Novagen 公司，美國(guó))二、主要酶和試劑1.逆轉(zhuǎn)錄試劑盒((Τ0Υ0Β0公司，日本)2. Luria-Bertani medium(Difco 公司，美國(guó))3. KOD Plus DNA Polymerase (Τ0Υ0Β0 公司，日本)4.限制性?xún)?nèi)切酶 Nco、HindIII、EcoRI、XhoI (Τ0Υ0Β0 公司，日本)5. DNA 連接酶 solution I (TAKARA 公司，日本)6.多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑Taq聚合酶(TAKARA公司，日本)
7. dNTPs (TAKARA 公司，日本)8. DNA marker (北京天根公司，中國(guó))9. IPTG (Sigma 公司，美國(guó))10. Trx and Trx antibody (R&D 公司，美國(guó))13. a-crystalIin (Sigma 公司，美國(guó))14. aB-crystallin antibody (&inta 公司，美國(guó))15. Primers (Sangon ^W], ψ H )16. aB-crystallin (Cell Sciences)17. Tris堿(TBD生物技術(shù)發(fā)展中心，中國(guó))18.甘氨酸(綠鳥(niǎo)科技發(fā)展有限公司，中國(guó))19. SDS (TBD生物技術(shù)發(fā)展中心，中國(guó))20.預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)marker (中山生物技術(shù)有限公司，中國(guó))22.辣根酶標(biāo)記的抗兔IgG(中山生物技術(shù)有限公司，中國(guó))23.化學(xué)發(fā)光顯影劑(Pierce公司，美國(guó))M.BCA法蛋白定量試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司，中國(guó))25.堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(中山生物技術(shù)有限公司，中國(guó))三、主要儀器1.超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰公司，中國(guó))2.轉(zhuǎn)膜儀(杭州博日科技有限公司，中國(guó))3·圖像分析儀(Leica公司，德國(guó))
4.凝膠成像系統(tǒng)(BIV-RAD公司，美國(guó))5.自動(dòng)凝膠層析儀(MB99-2)(滬西分析儀器廠，中國(guó))6.紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Tu-1900)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，中國(guó))
四、主要配方Sterile filtered liquid in 20mM Tris-HCl, pH 7. 5+50mM NaCl+lmM EDTA1.磷酸緩沖液的配制(0. 05mol/L, pH6. 7)稱(chēng)磷酸氫二鈉7. 7895g，磷酸二氫鈉 4. 407g溶于雙蒸水中，定容至1L，過(guò)濾去除雜質(zhì)。2.電泳緩沖液的配制(5X) :Tris堿15. lg，SDS 5g，甘氨酸94g，加雙蒸水至 IOOOml 定容。3. 12% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺電泳-分離膠的配制30%丙烯酰胺溶液 4. 0ml，10 % SDS 0. lml，10 % 過(guò)硫酸胺 0. lml，1. 5mmol/L Tris 2. 5ml (pH8. 8)，TEMED 0. 004ml，雙蒸水 3. 3ml，共 10ml。4.5% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺電泳-積層膠的配制30%丙烯酰胺溶液 0. 83ml, 10% SDS 0. 05ml, 10%過(guò)硫酸胺 0. 05ml, 1. Ommo 1/L Tris 0. 63ml (pH 6. 8)，TEMED 0. 005ml，雙蒸水 3. 4ml，共 5ml。5. 10%過(guò)硫酸胺的配制過(guò)硫酸胺lg，加雙蒸水至IOml定容。6.上樣緩沖液的配制(2X)雙蒸水 5ml，0. lmol/L Tris-HCl (pH 6. 8)5ml,4% (w/v) SDS20ml,20% (v/v)甘油 10ml, 0. 2mol/L 2_b_ 巰基乙醇 0. 25g，0. 2% (w/v)溴酚藍(lán) 0. 08g。7.轉(zhuǎn)膜緩沖液甲醇 200ml，甘氨酸 2. 9g，SDSO. 37g，Tris5. 8g，雙蒸水 1000ml。8. TBST 緩沖液(PH7. 5) :Tween200. 5ml, NaC18. 76g, Tris6. 05g，雙蒸水 1000ml。五、實(shí)驗(yàn)方法(一)人αB-晶體蛋白基因獲得在GenBank中檢索到人α B-晶體蛋白的序列為Seq ID NO. 1所示。根據(jù)大腸桿菌的密碼子使用偏好，將人α B-crystallin的氨基酸序列轉(zhuǎn)化DNA序列，人工合成cDNA序列。(二)目的基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)人α B-晶體蛋白的基因序列及pET3h載體的多克隆位點(diǎn)，采用I^rimer 5. 0 軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增人α B-晶體蛋白基因的特異性引物。上游引物序列為5' -GGAATTGATCG CCATCCACCAC-3‘，下游引物序列為5' -CCGCTCGAGCTATTTCTTGGGGGCTGC GG-3‘。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為Μ^ρ。1、變性反應(yīng)體系為
權(quán)利要求
1.人αB-晶體蛋白在制備保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用。
2.保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物，其特征在于其有效成分為分離純化的重組人 α B-晶體蛋白，所述重組人α B-晶體蛋白的氨基酸序列如kq ID No. 1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物，劑型為注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，所述注射劑所用的溶劑，pH7.5，配方為20!111 Tris-HCl、50mM 氯化鈉、ImMEDTA、無(wú)菌水。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物，所述重組人αΒ-晶體蛋白是人工構(gòu)建的包含有如％(1 IDNo. 2所示的核苷酸序列的重組表達(dá)載體在體外表達(dá)，然后經(jīng)分離純化而得的重組蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物，所述體外表達(dá)指將重組表達(dá)載體 pET28a-aB-crystallin轉(zhuǎn)染到BL21細(xì)胞中，誘導(dǎo)陽(yáng)性BL21細(xì)胞表達(dá)重組人α B-晶體蛋白。
7.權(quán)利要求1 7任一所述的藥物的制備方法將分離純化的重組人αB-晶體蛋白溶于不影響α B-晶體蛋白活性且適用于人體注射的溶劑中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，所述重組人αB-晶體蛋白是人工構(gòu)建的包含有如 Seq IDNo. 2所示的核苷酸序列的重組表達(dá)載體在體外表達(dá)，然后經(jīng)分離純化而得的重組蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，所述體外表達(dá)指將所述重組表達(dá)載體 pET28a-aB-crystallin轉(zhuǎn)染到BL21細(xì)胞中，誘導(dǎo)陽(yáng)性BL21細(xì)胞表達(dá)重組人α B-晶體蛋白。
全文摘要
本發(fā)明“人αB-晶體蛋白在制備保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物中的應(yīng)用”，屬于生物制藥領(lǐng)域。所述保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的藥物，其特征在于其有效成分為分離純化的αB-晶體蛋白。本發(fā)明提供的藥物中的有效成分αB-晶體蛋白能夠顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGCs的存活及軸突再生，試驗(yàn)證明，是一種對(duì)損傷后的視神經(jīng)能起到恢復(fù)視功能的有效藥物。
文檔編號(hào)A61K9/08GK102210851SQ20111014497
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月31日
發(fā)明者吳楠, 應(yīng)希, 王一, 王蕊, 黃小勇 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院