專利名稱：間充質(zhì)干細(xì)胞在干燥綜合征中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本研究涉及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs)抑制干燥綜合征(SjGgren's Syndrome，SS)患者T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能及其在SS 小鼠中的治療作用。
背景技術(shù)：
MSCs是一類具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，可從血液、肝臟、骨髓、脂肪、皮膚等 多種組織獲得，是一群多潛能細(xì)胞，可以向多種組織細(xì)胞如骨、軟骨、肌肉、韌帶、肌腱、脂肪 等分化。目前，MSCs主要來源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且隨 著年齡增長(zhǎng)其細(xì)胞數(shù)量和擴(kuò)增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，故尋找一種能替代骨髓MSCs， 并可彌補(bǔ)其缺陷的MSCs來源，已越來越受到各國(guó)學(xué)者的關(guān)注。其他方法如從臍帶血和外周 血中培養(yǎng)MSCs具有一定難度，且MSCs在足月分娩的臍帶血或動(dòng)員的外周血中數(shù)量尚存在 爭(zhēng)議。因此，從分娩后的廢棄材料臍帶中分離培養(yǎng)UCMSCs，為MSCs的應(yīng)用提供了新的材料 來源和基礎(chǔ)資料。SS是一種以侵及淚腺和唾液腺等外分泌腺為特征的全身性自身免疫疾病。該病最 常見的臨床表現(xiàn)為眼干、口干，并可累及肺、腎臟、淋巴系統(tǒng)、血管及肝臟等器官。此病無(wú)明 顯的地區(qū)分布差異，可發(fā)生于任何年齡，以40-60歲，特別是絕經(jīng)后的女性居多，男女之比 為1 :9。在我國(guó)的患病率為0.77%，在老年人群中的患病率高達(dá)4%，全國(guó)有近1000萬(wàn)患 者?，F(xiàn)有SS的治療方法包括傳統(tǒng)的免疫抑制劑及生物制劑，存在副作用大、價(jià)錢高等弊端， 為此需要不斷尋求更經(jīng)濟(jì)有效且無(wú)明顯副作用的治療方法。NOD小鼠是目前國(guó)際上比較公 認(rèn)的SS自發(fā)鼠模型。已有的研究證實(shí)，MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能，多項(xiàng)研究表明MSCs可抑制 多種自身免疫病患者T細(xì)胞的增殖及炎性細(xì)胞因子的分泌。為此，本課題組利用UCMSCs在 體外與SS患者T細(xì)胞共培養(yǎng)，并將UCMSCs移植到NOD體內(nèi)，觀察UCMSCs在SS治療中的作 用。發(fā)現(xiàn)UCMSCs可抑制T細(xì)胞的免疫功能并明顯改善了 NOD的唾液流率及組織病理。為 UCMSCs治療SS的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本研究利用UCMSCs在體外與SS患者T細(xì)胞共培養(yǎng)，并將UCMSCs移植到NOD小鼠 體內(nèi)，觀察其在SS治療中的作用。發(fā)現(xiàn)UCMSCs可抑制T細(xì)胞的增殖，抑制炎性細(xì)胞因子 (TNF- α、IL-6、IFN- γ )的分泌，上調(diào)IL-10的表達(dá)，上調(diào)CD4+F0XP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)，并明 顯改善了 NOD的唾液流率及組織病理。為UCMSCs治療SS的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。


圖1. UC-MSCs的鑒定㈧UCMSCs形態(tài)特征(第三代)⑶流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表型 分析(C) :UCMSCs的脂肪誘導(dǎo)分化-油紅0染色(D) :UCMSCs的成骨誘導(dǎo)分化-堿性磷酸酶 染色
圖2. UC-MSCs對(duì)NOD小鼠的治療作用(A)無(wú)論在4周及8周給藥，UC-MSCs均能 明顯抑制NOD小鼠唾液流量的下降，*P < 0. 05，< 0. 01 (B)無(wú)論在4周及8周給藥， UC-MSCs均能明顯降低NOD小鼠血清中SS相關(guān)抗體的表達(dá)，*P < 0. 05，**P < 0. 01 (C)組 織病理學(xué)顯示，UC-MSCs能明顯改善NOD小鼠頌下腺灶性淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)圖3. UC-MSCs對(duì)NOD小鼠的脾臟單個(gè)核細(xì)胞(MNCs)的免疫調(diào)節(jié)功能(A) =UCMSCs 治療組麗Cs的增殖能力較PBS組明顯降低，< 0.01 (B) =UCMSCs治療組麗Cs中調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(Treg)的表達(dá)較PBS組明顯上調(diào)，*P < 0. 05(C)在體外，將未干預(yù)的16周齡NOD 小鼠麗Cs與UCMSCs共培養(yǎng)，可見UCMSCs能明顯上調(diào)Treg的表達(dá)，**P < 0. 01圖4. UC-MSCs對(duì)NOD小鼠細(xì)胞因子分泌的影響(A) =UC-MSCs可下調(diào)NOD小鼠血 清中IL-6的表達(dá)，< 0. 01 (B) =UCMSCs治療組與PBS組相比，MNCs細(xì)胞上清中IL-6表 達(dá)下調(diào)，IL-10表達(dá)上調(diào)，< 0.01(C)在體外，將未干預(yù)的16周齡NOD小鼠MNCs與 UCMSCs共培養(yǎng)，可見UCMSCs能明顯下調(diào)TNF-α、IFN-γ的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)，**Ρ
<0. OIUC-MSCs對(duì)SS患者T細(xì)胞的影響(A) =UC-MSCs可抑制T細(xì)胞的增殖，并呈劑量依 賴性，*Ρ < 0. 05，< 0. 01 (B)抗IL-10單抗可逆轉(zhuǎn)UC-MSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作 用，#P< 0.01(C):優(yōu)1^08與1~細(xì)胞共培養(yǎng)，可下調(diào)1順-0的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)，*Ρ
<0. 05 (D) =UCMSCs能明顯上調(diào)SS患者Treg的表達(dá)，*Ρ < 0. 0具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)。a.取正常陰道分娩或剖腹產(chǎn)臍帶，經(jīng)過嚴(yán)格檢測(cè)程序(ABO/Rh血型檢測(cè)，HLA分型 檢測(cè)，梅毒抗體檢測(cè)，HIV免疫檢測(cè)，CMV抗體檢測(cè)，乙型肝炎抗原抗體檢測(cè))確定安全后，無(wú) 菌生理鹽水沖洗去除肉眼可見污物及血液。 b.無(wú)菌手工剪臍帶至3-5mm大小。c.將步驟b中獲得的組織塊，轉(zhuǎn)移入50ml離心管中，加入含青鏈霉素的 PBS40ml，室溫離心250g 5分鐘，棄上清。d.步驟c所獲組織塊用10% α MEM培養(yǎng)，每3天換液。e.至7天左右組織塊周圍有梭形及多角形細(xì)胞爬出，且逐漸增多。f.至10-14天左右細(xì)胞達(dá)80%左右融合時(shí)，用0. 25%胰酶消化傳代。g.以后每隔3-5天傳代一次。h.至第三代鑒定。i.經(jīng)鑒定后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)備用或凍存。見圖1。實(shí)施例2 =UCMSCs對(duì)NOD小鼠的治療作用該實(shí)驗(yàn)分為預(yù)防組及治療組。預(yù)防組選取4周齡雌性NOD小鼠20只，治療組選取 8周齡雌性NOD小鼠20只。各組內(nèi)20只小鼠隨機(jī)分為2組。分別給予UC-MSCs及PBS。腹 腔注射1Χ 106/100ιι1細(xì)胞，共一次。每?jī)芍苓M(jìn)行唾液流量測(cè)定。至第16W結(jié)束觀察。留取 小鼠血清，頌下腺組織及脾細(xì)胞，ELISA檢測(cè)小鼠血清SS相關(guān)抗體，HE染色做頌下腺病理學(xué) 分析。結(jié)果顯示治療組及預(yù)防組NOD小鼠，UC-MSCs均能明顯增加其唾液流量；能明顯降低 NOD小鼠血清中抗體的表達(dá)；組織病理學(xué)顯示，UC-MSCs能明顯改善NOD小鼠頌下腺灶性淋
4巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。見圖2。實(shí)施例3 =UCMSCs對(duì)NOD小鼠MNCs的免疫調(diào)節(jié)功能(A)取UCMSCs治療組及PBS組MNCs，4 X IO5/孔接種于96孔板中，每孔均加 ConA (2 μ g/ml)刺激。120小時(shí)，3H摻入法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。UCMSCs治療組的MNCs增 殖能力較PBS組明顯降低(B)同理，取UCMSCs治療組及PBS組MNCs，2X IO6/孔接種于 24孔板，48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞Treg的表達(dá)，UCMSCs治療組MNCs中Treg 的表達(dá)較PBS組明顯上調(diào)(C):在體外，將未干預(yù)的16周齡NOD小鼠MNCs(1X106/^L) 與UCMSCs (2 X IO4/孔)共培養(yǎng)，48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞Treg的表達(dá)，可見 UCMSCs能明顯上調(diào)Treg的表達(dá)。見圖3。實(shí)施例4 =UCMSCs對(duì)NOD小鼠細(xì)胞因子分泌的影響(A)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，留取小鼠血清，ELISA檢測(cè)小鼠血清中細(xì)胞因子分泌，發(fā)現(xiàn) UC-MSCs可下調(diào)NOD小鼠血清中IL-6的表達(dá)(B)取UCMSCs治療組及PBS組MNCs，2 X IO6/ 孔接種于24孔板，48小時(shí)后，收取細(xì)胞上清，檢測(cè)細(xì)胞因子，結(jié)果顯示UCMSCs治療組與PBS 組相比，MNCs細(xì)胞上清中IL-6表達(dá)下調(diào)，IL-10表達(dá)上調(diào)(C)在體外，將未干預(yù)的16周齡 NOD小鼠MNCs (1 X IO6/孔)與UCMSCs (2 X IO4/孔)共培養(yǎng)，48小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì) 胞因子，可見UCMSCs能明顯下調(diào)TNF-α、IFN-γ的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)。見圖4。實(shí)施例5 =UC-MSCs對(duì)SS患者T細(xì)胞的影響(A)分離SS患者外周血PBMC，磁珠分選⑶3+Τ細(xì)胞。分成兩組，一組為UCMSCs 與τ細(xì)胞共培養(yǎng)組，一組為單純T細(xì)胞對(duì)照組，兩組均加⑶3/⑶28 (5 μ g/ml)刺激。120小 時(shí)，3H摻入法檢測(cè)T細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論UCMSCs與T細(xì)胞是否接觸，共培養(yǎng)組T 細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且呈劑量依賴性。(B)在UCMSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，加入抗 IL-10單抗(10 μ g/ml)，可逆轉(zhuǎn)UC-MSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用(C)將SS患者T細(xì)胞 (1X106/孔)與UCMSCs (2X IO4/孔)共培養(yǎng)，48小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子，可見 UCMSCs可下調(diào)TNF- α的表達(dá)，上調(diào)IL-10的表達(dá)(D)將SS患者T細(xì)胞(1 X IO6/孔)與 UCMSCs (2 X IO4/孔)共培養(yǎng)，48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg的表達(dá)，UCMSCs能明顯上調(diào) SS患者Treg的表達(dá)。見圖5。
權(quán)利要求
各種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的間充質(zhì)干細(xì)胞在治療干燥綜合征中的用途。
3.權(quán)利要求1的間充質(zhì)干細(xì)胞施用給干燥綜合征患者。
4.權(quán)利要求1的間充質(zhì)干細(xì)胞在治療其它自身免疫病中的用途。
5.權(quán)利要求1的間充質(zhì)干細(xì)胞施用給其它自身免疫病患者。
全文摘要
本發(fā)明證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞可用于干燥綜合征的治療。其特征在于抑制干燥綜合征的異常免疫反應(yīng)，從根本上控制本病的發(fā)展。
文檔編號(hào)A61K35/44GK101974483SQ201010503679
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者何菁, 劉燕鷹, 栗占國(guó) 申請(qǐng)人:北京大學(xué)人民醫(yī)院