專利名稱：羊胎多肽核酸營(yíng)養(yǎng)液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以羊胎為原料，富多肽核酸的營(yíng)養(yǎng)液的制備方法。
人和動(dòng)物的胎盤為傳統(tǒng)中藥，含有多種具有免疫調(diào)節(jié)作用的生物活性物質(zhì)，并富蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及核酸。胎兒是一個(gè)完整的生命，除含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸及核酸外，還含有大量的卵磷質(zhì)、不飽和脂肪酸、多種維生素和多種微量元素，更重要的是動(dòng)物胚胎中含有大量的生物活性物質(zhì)，對(duì)生物的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、新陳代謝有十分重要的作用，并且胎兒中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)有易吸收、利用率高的優(yōu)點(diǎn)。
在動(dòng)物制品中，有些注重其生物活性，而只透析獲得具有免疫活性胎盤肽，而沒有利用胎盤中極為豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。較多的是采用高溫滅菌后再提取營(yíng)養(yǎng)成份，傳統(tǒng)中醫(yī)也是煮后用藥，因而致使部分營(yíng)養(yǎng)成分(如蛋白質(zhì)、維生素等)的高溫破壞和生物活性物質(zhì)活性喪失。雖然有全胎盤低溫冷凍干燥制品的出現(xiàn)，使生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分得以保留，但其吸收率和利用率不高，并且只能用于口服，而不能做成注射針劑和化妝品。同時(shí)，多數(shù)胎盤制品忽略了胎盤及胎兒中營(yíng)養(yǎng)極高的核酸資源。
本發(fā)明的目的在于提供一種羊胎多肽核酸營(yíng)養(yǎng)液的制備方法。它既能有效提取并保存胎盤中的生物活性物質(zhì)，又能充分提取胎盤中營(yíng)養(yǎng)豐富的蛋白質(zhì)和核酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。主要解決已有技術(shù)對(duì)有效組份和營(yíng)養(yǎng)成份的提取不完全、損失多、吸收率少等缺點(diǎn)。同時(shí)，提供一種多肽基因滋補(bǔ)品及免疫制劑。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)來實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)液包括胎盤透析液、蛋白質(zhì)水解液和核酸制備工藝流程如下包括生物活性物質(zhì)的抽提和蛋白質(zhì)水解及核酸抽提三大步驟。
1、活性物質(zhì)的抽提。
(1)原料處理取1～3個(gè)月羊全胎盤(包括胎兒和胎盤)在-20℃～-40℃迅速冷凍、洗凈、清理并去除結(jié)締組織和臍帶。
(2)碎胎盤組織將組織剪成小塊，在勻漿器中勻漿，于-60℃～-80℃速凍，之后于15℃～30℃融化，反復(fù)凍融。
(3)活性物質(zhì)的制備將上述凍融產(chǎn)物離心，取上述清液經(jīng)透析或超濾，再用微孔濾膜過濾除菌即得含有豐富的生物活性物質(zhì)胎盤轉(zhuǎn)移因子。
2、蛋白水解液的制備，取上述離心所得的沉淀部分，采用酶-酸聯(lián)合水解。
(1)酶水解，取沉淀加蒸餾水，煮沸消毒，無(wú)菌條件下調(diào)PH至7～8加胰酶，溫度控制在36℃～42℃，酶解。
(2)上述水解物，加溫煮沸后，調(diào)PH至3±0.5，高溫高壓水解，之后調(diào)PH值至6+0.5抽濾除去沉淀，收集清液即蛋白質(zhì)水解液，其中含有各種大小的肽段及各種核酸。
3、進(jìn)一步抽提核酸(1)在上述抽濾的沉淀中加入蒸餾水，充分混均，采用超聲處理儀對(duì)剩余的基因組DNA進(jìn)行剪切，50℃±5℃孵育，過濾去除殘?jiān)坝椭?br> (2)飽和酚抽提，加同體積的飽和酚，混勻，離心分離。
(3)上述所得吸入另一干凈窗口中，即得核酸溶液。
以上各提取液于低溫儲(chǔ)存待用。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、獲得的胎盤制劑，保留了胎盤中96％的天然活性成份。其中有與人體健康極為密切的SOD(見表1)2、酶-酸聯(lián)合水解方法，大幅度提高了氨基酸、短肽等物質(zhì)的含量，并且其中所含豐富的小分子營(yíng)養(yǎng)物易被人體吸收。而且8種必需氨基酸占總量的百分比為42.48％(見表2)。并含有豐富的微量元素(見表3)。
3、本發(fā)獲得的胎盤制劑，含有豐富的極利于吸收的核苷酸、各種大小核酸片段等核酸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種較好的基因營(yíng)養(yǎng)保健品。(見表1)4、此方法科學(xué)合理，全部原料為天然物質(zhì)，來源廣泛，流程短，操作簡(jiǎn)單，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，有較好的應(yīng)用開發(fā)前景。
表1營(yíng)養(yǎng)液的性質(zhì)及主要成份項(xiàng)目含量性狀棕色透明液體
PH值 6.8密度 1.21g/cm3氨基酸33.68mg/ml蛋白質(zhì)27mg/ml超氧化物歧化酶639u/ml核酸 1.63mg/ml(1)用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定超氧化物歧化酶活力。
(2)定磷法測(cè)定核酸含量。
(3)蛋白質(zhì)及多肽濃度測(cè)定采用Lowry法。
表2營(yíng)養(yǎng)液各種氨基酸含量(mg/ml)氨基酸量 氨基酸量Ser 1.15Tyr 0.31ASP 3.69Ile 2.66Glu 4.36Phe 2.11Val 1.48Pro 2.69Ala 2.47Lys 3.43Met 0.90Trp 0.25Cys 0.32His 0.62Thr 1.54Leu 1.94Gly 2.23Arg 1.53氨基酸含量用Bechman 121MB氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。
表3制劑中部分微量元素含量(ug/ml)元素 含量 元素 含量錳0.179 鐵0.85鈣0.92 銅0.18鋅0.16 鍺0.0047硒0.0052鋰0.0016
鈷 0.0067微量元素含量采用原子吸收法測(cè)定。
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明
1、活性物質(zhì)的抽提。
(1)原料處理取1～3個(gè)月羊全胎盤(包括胎兒胎盤)在-40℃迅速冷凍，4℃生理鹽水洗凈、清理并去除結(jié)締組織和臍帶。
(2)碎胎盤組織將組織剪成小塊，使用勻漿器，12000轉(zhuǎn)5分鐘勻漿5次；于-70℃速凍，之后于25℃融化，反復(fù)凍融9次。
(3)活性物質(zhì)的制備將上述凍融產(chǎn)物在0～4℃10000rpm離心20分鐘，取上清液經(jīng)透析或超濾，再用0.22或0.3ul的微孔濾膜過濾除菌即得含有豐富的生物活性物質(zhì)胎盤轉(zhuǎn)移因子。
2、蛋白水解液的制備，取上述離心所得的沉淀部分，采用酶-酸聯(lián)合水解。
(1)酶水解，取沉淀加6倍重量蒸餾水，煮沸10分鐘消毒，無(wú)菌條件下調(diào)PH至7.5加胰酶(胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)，酶用量為1∶250，溫度控制在36℃左右，酶解6h。
(2)上述水解物，加溫煮沸后，加HCI調(diào)PH至3左右條件下。高溫高壓水解3h，降至常溫，之后再高溫高壓水解3h之后，用NaOH調(diào)ph至6左右。抽濾除去沉淀，收集清液即蛋白質(zhì)水解液，其中亦含有各種大小的肽段及各種核酸。
3、進(jìn)一步抽提核酸(1)在上述抽濾的沉淀中加入2倍體積的蒸餾水，充分混均，采用帶有浸入尖頭的超聲處理儀對(duì)剩余的基因組DNA進(jìn)行剪切，最大功率處理1分鐘，重復(fù)5次，50℃孵育10分鐘，過濾去除殘?jiān)坝椭?br> (2)飽和酚抽提，加同體積的飽和酚，混勻，離心(12000rpm，4℃)15分鐘。
(3)上清即得吸入另一干凈窗口中，即得核酸溶液。
以上各提取液于-2℃儲(chǔ)存待用。
本發(fā)明所得產(chǎn)品可用做保健品、化妝品及免疫調(diào)節(jié)劑。
權(quán)利要求
1.羊胎多肽核酸營(yíng)養(yǎng)液的制備方法，其特征是由下述工藝步驟組成(1)活性物質(zhì)抽提(a)原料處理取羊全胎，包括胎兒和胎盤，在-20℃-40℃迅速冷凍、洗凈、清理并去除結(jié)締組織和臍帶。(b)破碎胎盤組織將組織在勻漿器中勻漿，于-60℃-80℃速凍，之后于15-30℃融化，反復(fù)凍融。(c)活性物質(zhì)的制備將上述凍融產(chǎn)物離心分離，取上清液經(jīng)透析或超濾，用微孔濾膜過濾除菌即得含有豐富的生物活性物質(zhì)胎盤轉(zhuǎn)移因子。(2)蛋白水解液的制備(a)酶水解，取上述離心所得的沉淀加水煮沸消毒，調(diào)PH值7-8加入胰酶36℃-42℃酶解；(b)上述水解物加溫煮沸后，調(diào)PH值3±0.5，高溫高壓水解，之后調(diào)PH值至6±0.5抽濾去沉淀，收集清液即蛋白質(zhì)水解液，其中含有各種肽段和核酸；(3)進(jìn)一步抽提核酸(a)在上述抽濾的沉淀中加入水混均，采用超聲處理儀對(duì)剩余的基因組DNA進(jìn)行剪切，50℃±5℃孵育，過濾去除殘?jiān)坝椭?b)飽和酚抽提，加入同體積的飽和酚，離心分離。上清液即得吸入另一干凈窗口中，即得核酸溶液；以上各提取液于低溫儲(chǔ)存待用。
全文摘要
一種羊胎多肽核酸營(yíng)養(yǎng)液的制備方法,將羊全胎速凍后清洗去除結(jié)締組織和臍帶;使用勻漿器勻漿后,在－60℃～－80℃速凍,于15～30℃融化,反復(fù)凍融多次,凍融物經(jīng)離心,上清液經(jīng)透析或超濾,除菌后得胎盤轉(zhuǎn)移因子;將上述離心沉淀酶解后水解抽濾得蛋白質(zhì)水解液,含有各種肽段和核酸;將上述抽濾沉淀物超聲處理,經(jīng)孵育后,去殘?jiān)坝椭?加入飽和酚離心,得到核酸溶液。該方法有效組份和營(yíng)養(yǎng)提取完全,吸收率高,營(yíng)養(yǎng)液可制成保健品,化妝品及免疫調(diào)節(jié)劑。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1298709SQ0013231
公開日2001年6月13日 申請(qǐng)日期2000年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月3日
發(fā)明者方武, 陳志強(qiáng), 黃耀江 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古草原興發(fā)股份有限公司