專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取法，具體涉及一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
芡實(shí)始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，又名雞頭子，歷版《中國(guó)藥典》均有記載，為睡蓮科一年生水生草本植物芡的干燥成熟種仁，具有益腎固精，補(bǔ)脾止瀉，祛濕止帶的功效，主治夢(mèng)遺、滑精，遺尿、尿頻、脾虛久瀉、白濁、帶下，素有“水中人參”和“水中桂圓”的美譽(yù)，是傳統(tǒng)的中藥材和珍貴的天然補(bǔ)品。我國(guó)是世界上老齡化發(fā)展速度最快的國(guó)家之一，也是老齡人口最多的國(guó)家之一。
2005年底全國(guó)I %人口抽樣顯示，65歲以上人口占總?cè)丝跀?shù)的7.7%，預(yù)測(cè)到2020年65歲以上老年人口將達(dá)11. 92%。衰老是一種復(fù)雜的生命現(xiàn)象，衰老時(shí)機(jī)體的各項(xiàng)機(jī)能均趨于下降，通常表現(xiàn)為一系列形體的老化及行為異常，如毛發(fā)脫落、皮膚松弛、老年斑堆積、思維判斷能力減弱甚至癡呆等。因此，形體的老化及行為學(xué)考察通常被作為衰老模型制備成功的標(biāo)志。目前有關(guān)衰老的學(xué)說(shuō)很多，包括自由基學(xué)說(shuō)、遺傳程序?qū)W說(shuō)、脂褐素累積學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌功能減退學(xué)說(shuō)等，其中自由基損傷在衰老機(jī)制的研究中占有十分重要的地位。GSH-Px是機(jī)體一種抗氧化的重要酶，它特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)過(guò)氧化物的還原反應(yīng)，其作用在于阻斷由過(guò)氧化物引發(fā)的自由基對(duì)機(jī)體的損害，保護(hù)細(xì)胞膜免受過(guò)氧化損傷。一氧化氮合成酶(NOS)在體內(nèi)能催化NO生成，NO既是一種神經(jīng)遞質(zhì)，也是一種極不穩(wěn)定的強(qiáng)氧化劑，但腦內(nèi)過(guò)多的NO沉積會(huì)發(fā)生細(xì)胞毒性反應(yīng)，這可能與誘生型NOS的過(guò)表達(dá)有關(guān)。乙酰膽堿酯酶(AChE)是在膽堿能神經(jīng)元的突觸處水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)的酶，AChE含量的變化在一定程度上可體現(xiàn)膽堿能神經(jīng)元的功能活性。中醫(yī)藥在抗氧化、抗衰老活性方面具有獨(dú)體的優(yōu)勢(shì)，因此從中草藥中尋找純天然、抗氧化、抗衰老活性強(qiáng)的物質(zhì)具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，從中藥芡實(shí)中提取分離得到抗氧化、抗衰老活性強(qiáng)，不良反應(yīng)低的提取物，本發(fā)明另一個(gè)目的是提供芡實(shí)提取物的制備方法和其應(yīng)用。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物，它是通過(guò)以下方法制備得到(I)取芡實(shí)藥材，凈選，去除雜質(zhì)，置多功能提取罐內(nèi)，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)乙醇提取物，備用。
(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實(shí)乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用；(3) 取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹(shù)脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識(shí)、收集50% 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實(shí)提取物。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物中5，7，4/ -三羥基二氫黃酮的百分含量為10%至20%。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物，其步驟(I)所述的提取方法為回流提取法；步驟(I)所述的提取溶劑乙醇的濃度為80%。本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選提取方法和提取溶劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑為濃度為80%乙醇，在回流提取法下，芡實(shí)中抗氧化、抗衰老活性成分提取效率最高。本發(fā)明步驟(I)得到乙醇提取物，為了進(jìn)一步提純活性成分，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)選的溶劑進(jìn)行萃取，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選表明，采用乙酸乙酯或正丁醇進(jìn)行萃取能夠?qū)④蛯?shí)乙醇提取物中的抗氧化、抗衰老活性成分最大限度的分離出，將雜質(zhì)去掉，從而保證藥效，最大程度降低不良反應(yīng)。本發(fā)明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法，其包括以下步驟(I)取芡實(shí)藥材，凈選，去除雜質(zhì)，置多功能提取罐內(nèi)，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)乙醇提取物，備用。(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實(shí)乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用；(3)取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹(shù)脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識(shí)、收集50% 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實(shí)提取物。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法，步驟(I)所述的提取方法為回流提取法、提取溶劑乙醇的濃度為80%。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法，步驟(3)所述的大孔吸附樹(shù)脂為DlOl型大孔吸附樹(shù)脂。本發(fā)明通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)篩選不同極性不同型號(hào)的大孔樹(shù)脂、不同濃度(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% )的乙醇洗脫齊U，以抗氧化、抗衰老為藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以非極性大孔吸附樹(shù)脂DlOl型大孔吸附樹(shù)脂除雜效果比較好，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明濃度為10%的乙醇可以洗脫大部分極性稍大的雜質(zhì)，而濃度為50%至60%的乙醇對(duì)抗氧化、抗衰老活性成分的洗脫能力最好，因此本發(fā)明經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果確定出最佳的吸附材料為DlOl型大孔吸附樹(shù)脂和最佳的洗脫劑為濃度為50%至60%的乙醇。作為優(yōu)選方案，以上所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法分離得到的芡實(shí)提取物，檢測(cè)結(jié)構(gòu)表明提取物中5，7，4'-三羥基二氫黃酮的百分含量為10%至 20%。本發(fā)明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有很好的抗氧化、延緩衰老的功效，可以用于制備抗氧化、抗衰老保健品或用于制備抗缺血性損傷疾病藥物。有益效果本發(fā)明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)I、本發(fā)明以抗氧化、抗衰老為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出最佳制備方法，分離得到的芡實(shí)提取物，活性成分含量高，雜質(zhì)少，藥效明顯，在曠場(chǎng)、Morris水迷宮的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明提供的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物對(duì)亞急性衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有很好的改善作用，對(duì)亞急性衰老小鼠的脾、腎臟器指數(shù)有明顯提高作用，且可以提高亞急性衰老小鼠腦組織NOS、GSH-Px活力，降低AChE活力。2、本發(fā)明提供的芡實(shí)提取物能提高亞急性衰老小鼠腦組織GSH-Px的活力，并隨 劑量的增高，酶活性有增加的趨勢(shì)，顯示出了良好的抗氧化作用，清除自由基和抗衰老作用。3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的芡實(shí)提取物能夠降低亞急性衰老小鼠腦組織中AChE的活力，從而可提高小鼠腦內(nèi)ACh的含量，具有改善衰老引起的學(xué)習(xí)記憶功能下降的作用。4、D_半乳糖致衰老模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的芡實(shí)提取物能明顯抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，甚至達(dá)到或超過(guò)正常水平，進(jìn)一步從病理學(xué)角度證明芡實(shí)提取物能改善D-半乳糖致衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。本發(fā)明提供的芡實(shí)提取物，活性強(qiáng)，藥效全面，且不良反應(yīng)低，和現(xiàn)有技術(shù)相比取得了很好的技術(shù)效果。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例I一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物，它通過(guò)以下方法制備得到(I)取芡實(shí)藥材，凈選，去除雜質(zhì)，置多功能提取罐內(nèi)，加8倍量濃度為80%的乙醇，回流提取3次，每次提取8小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)乙醇提取物，備用。(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實(shí)乙醇提取物，加水混懸后，用相同體積的乙酸乙酯萃取6次，得乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)的乙酸乙酯提取物，備用；(3)取步驟⑵制備得到的乙酸乙酯提取物上DlOl型大孔吸附樹(shù)脂，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識(shí)、收集50% 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有10% 5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實(shí)提取物。實(shí)施例2一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物，它通過(guò)以下方法制備得到
(I)取芡實(shí)藥材，凈選，去除雜質(zhì)，置多功能提取罐內(nèi)，加6倍量濃度為80%的乙醇，回流提取3次，每次提取8小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)乙醇提取物，備用。(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實(shí)乙醇提取物，加水混懸后，用相同體積的正丁醇萃取6次，得正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)的正丁醇提取物，備用；(3)取步驟(2)制備得到的正丁醇提取物上DlOl型大孔吸附樹(shù)脂，先分別用水和濃度為10 %乙醇洗脫，再用濃度為50 % 60 %的乙醇洗脫，薄層色譜檢識(shí)、收集50 % 60%乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有20% 5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實(shí)提取物。實(shí)施例3抗氧化、抗衰老實(shí)驗(yàn)I、實(shí)驗(yàn)材料
I. I試驗(yàn)藥物芡實(shí)購(gòu)于北京中葛綠元科技有限公司，批號(hào)110901 ;本發(fā)明實(shí)施例I和實(shí)施2制備得到的提取物。D-半乳糖，上海寶曼生物有限公司，批號(hào)110523。GSH_Px、N0S、AChE、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)20120416。I. 2試驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)KM小鼠，由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK (蘇)2009-0002 。I. 3實(shí)驗(yàn)儀器小鼠曠場(chǎng)裝置，上海軟隆科技發(fā)展有限公司。SLY-WMS型Morris水迷宮，北京碩林苑科技有限公司。FSH-2A可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)，金壇市金南儀器廠(chǎng)。LXJ-II B低速大容量多管離心機(jī)，南京曉曉?xún)x器設(shè)備有限公司。Powerwave X340全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司。2.實(shí)驗(yàn)方法2. I本發(fā)明中提取物對(duì)D-半乳糖所致小鼠亞急性衰老模型的作用取體重18 22g的雄性KM小鼠104只，隨機(jī)分成8組，S卩正常對(duì)照組、D-半乳糖模型對(duì)照組、本發(fā)明芡實(shí)80%乙醇提取物高、低劑量組、本發(fā)明實(shí)施例I提取物高、低劑量組、本發(fā)明實(shí)施例2提取物高、低劑量組，每組15只小鼠，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠每日腹腔注射0. 5% D-半乳糖，0. lml/10g，連續(xù)注射6周，正常對(duì)照組腹腔注射等量的無(wú)菌生理鹽水，同時(shí)開(kāi)始給藥，芡實(shí)80%乙醇提取物、實(shí)施例I提取物和實(shí)施例2提取物的高、低劑量組小鼠每日灌胃給藥劑量分別為0. 5g/kg和0. 25g/kg ;正常對(duì)照組及模型對(duì)照組每日灌胃同體積的生理鹽水。連續(xù)給藥6周后，測(cè)定各組小鼠的自主活動(dòng)情況，記錄小鼠90秒內(nèi)在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)和周邊區(qū)的平均運(yùn)行速度及跨格次數(shù)；然后采用水迷宮訓(xùn)練小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，記錄其學(xué)習(xí)成績(jī)，即2分鐘內(nèi)找到固定平臺(tái)的潛伏期及撤離平臺(tái)后，穿越原平臺(tái)所在象限的次數(shù)；比較組間差異并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；實(shí)驗(yàn)最后，脫頸椎處死小鼠，記錄小鼠的體重，取脾、腎稱(chēng)重，計(jì)算臟器指數(shù)。另取小鼠的腦組織勻漿后，測(cè)定腦組織中的GSH-Px、N0S、AChE的活性，比較組間差異并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)合上述各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)述本發(fā)明中各提取物的作用效果。分離小鼠腦組織海馬區(qū)，石蠟切片經(jīng)染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3. I本發(fā)明中提取物對(duì)D-半乳糖所致小鼠亞急性衰老模型的作用連續(xù)腹腔注射D-半乳糖6周后，除正常對(duì)照組外，各組小鼠肉眼可見(jiàn)皮毛無(wú)光澤且稀疏、行動(dòng)較為遲緩、精神萎靡不振等現(xiàn)象，對(duì)小鼠的自主活動(dòng)的影響見(jiàn)表I ;對(duì)小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)的影響見(jiàn)表2 ;對(duì)小鼠器官指數(shù)的影響見(jiàn)表3 ;對(duì)小鼠腦組織中各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。表I本發(fā)明提取物對(duì)亞急性衰老小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響(j±SD, n=13)
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物，其特征在于，它通過(guò)以下方法制備得到 (1)取芡實(shí)藥材，凈選，去除雜質(zhì)，置多功能提取罐內(nèi)，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)乙醇提取物，備用。
(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實(shí)乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用； (3)取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹(shù)脂柱，先分別用水和濃度為10%乙醇洗脫，再用濃度為50% 60%的乙醇洗脫，薄層色譜檢識(shí)、收集50% 60% 乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實(shí)提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物，其特征在于，步驟(I)所述的提取方法為回流提取法。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物，其特征在于，步驟(I)所述的提取溶劑乙醇的濃度為80%。
4.權(quán)利要求I所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取芡實(shí)藥材，凈選，去除雜質(zhì)，置多功能提取罐內(nèi)，加4至8倍量濃度為80%至90%的乙醇，提取I至3次，每次提取6至8小時(shí)，合并提取液，過(guò)濾，得濾液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)乙醇提取物，備用。
(2)取上述步驟(I)制備得到的芡實(shí)乙醇提取物，加水混懸后，用乙酸乙酯或正丁醇萃取3至6次，得乙酸乙酯或正丁醇萃取液，減壓濃縮，蒸干，得芡實(shí)的乙酸乙酯或正丁醇提取物，備用； (3)取步驟(2)制備得到的乙酸乙酯或正丁醇提取物上大孔樹(shù)脂柱，先分別用水和濃度為10 %乙醇洗脫，再用濃度為50 % 60 %的乙醇洗脫，薄層色譜檢識(shí)、收集50 % 60 %乙醇洗脫液、濃縮、減壓干燥得到含有5，7，4'-三羥基二氫黃酮的芡實(shí)提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法，其特征在于，步驟(I)所述的提取方法為回流提取法、提取溶劑乙醇的濃度為80%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的大孔吸附樹(shù)脂為DlOl型大孔吸附樹(shù)脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的芡實(shí)提取物中5，7，4'-三羥基二氫黃酮的百分含量為10至20%。
8.權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物在制備抗氧化、抗衰老保健品中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)所述的具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物在制備防治缺血性損傷疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有抗氧化、延緩衰老作用的芡實(shí)提取物及其制備方法，本發(fā)明通過(guò)提取溶劑、提取方法、萃取方法、大孔樹(shù)脂分離方法的系統(tǒng)優(yōu)化，得到最佳的制備工藝，制備得到的芡實(shí)提取物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的芡實(shí)提取物能夠明顯提高亞急性衰老小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的活動(dòng)能力和探究行為以及小鼠水迷宮測(cè)試中的學(xué)習(xí)成績(jī)和記憶能力，且能明顯提高小鼠的脾、腎臟器指數(shù)；并能升高腦組織中GSH-Px、NOS的活性及蛋白含量；降低腦組織AChE的活性；還能明顯改善腦組織病理改變，具有很好的抗氧化、抗衰老的功效。
文檔編號(hào)A61K36/62GK102793754SQ20121022604
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月3日
發(fā)明者吳啟南, 周婧, 樂(lè)巍, 段金廒, 沈蓓 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)